Les interactions entre les biomolécules, y compris les interactions protéine-protéine et protéine-ADN, sont essentielles dans la recherche en biochimie. Dans cette étude, nous utilisons l’interférométrie de biocouche, ou BLI, une technique efficace pour analyser ces interactions. Nous nous concentrons sur la protéine de réplication A et son affinité de liaison pour un ADN simple brin afin de mettre en évidence les principes et les capacités du BLI.
L’interférométrie des biocouches est une méthode simple et rentable pour étudier la cinétique des protéines. Il permet une surveillance rapide en temps réel des interactions entre les protéines et offre un flux de travail simple avec moins de complexité que les autres techniques. Dans notre laboratoire, nous étudions l’impact des modifications post-traductionnelles sur la structure et la fonction des protéines essentielles au maintien de la stabilité du génome.
Ces modifications peuvent déclencher des effets en cascade sur les voies de réplication et de réparation. En étudiant les interactions protéiques, nous visons à découvrir les mécanismes sous-jacents qui préservent l’intégrité du génome. Pour commencer, préparez 12,5 nanomolaires de trois substrats d’appât poly dT 32 monobrin bio de première qualité et quatre concentrations de RPA à l’aide d’un tampon BLI.
À l’aide d’une pipette, ajoutez 250 microlitres de tampon BLI dans deux tubes à microfuge de 0,5 millilitre et étiquetez-les comme AND. Dans une plaque séparée de 96 puits, pipetez 200 microlitres de tampon BLI dans un puits. Positionnez le plateau de biocapteurs sur la plaque à 96 puits de manière à ce qu’un biocapteur plonge dans le tampon BLI.
Sur le logiciel, cliquez sur l’option hydrater et réglez la minuterie sur 10 minutes. Ajustez les paramètres de course pour chaque étape, ligne de base, association et dissociation. Appuyez sur Exécuter le logiciel et suivez les instructions dans le message d’invite.
Placez deux baies dans le support de tube et fixez le biocapteur hydraté au système BLI. Faites glisser le support de tube sous le biocapteur en position A et surveillez la ligne de base du biocapteur. Après avoir terminé la ligne de base initiale, ouvrez le couvercle et ajoutez quatre microlitres de tampon BLI dans le support de goutte.
Faites glisser le support de chute vers la droite sous le même biocapteur en position B.Une fois le couvercle fermé, surveillez la courbe BLI sur le logiciel. Ouvrez ensuite le couvercle et remplacez le tube A par le tube D.Glissez le nouveau tube sous le biocapteur en position A avant de fermer le couvercle et analysez l’étape de dissociation dans l’interface. Placez le tube A dans le support de tube.
Fixez le biocapteur hydraté au système BLI et glissez le support de tube sous le biocapteur comme indiqué précédemment. Cliquez ensuite sur Exécuter sur l’interface du logiciel pour la configuration de base. Après avoir ajouté quatre microlitres d’appât d’ADN simple brin nanomolaire de 12,5 nanomolaires dans le support de goutte et l’avoir glissé sous le biocapteur pour l’étape d’association, surveillez la courbe BLI sur le logiciel.
Ouvrez ensuite le couvercle pour remplacer le tube A par D.Glissez-le sous le biocapteur et procédez à l’étape de dissociation. Une fois l’étape de dissociation terminée, ouvrez le couvercle et détachez le biocapteur. Placez ensuite le biocapteur dans le plateau contenant le tampon BLI.
À l’aide d’une pipette, ajoutez 250 microlitres de tampon BLI dans 10 tubes de microfuge noirs de 0,5 millilitre. Étiquetez les tubes de A1 à A5 et de D1 à D5. Remplissez les détails de l’expérience sur l’interface du logiciel et appuyez sur le bouton de calcul pour traiter les informations. Dans une pipette à plaque séparée de 96 puits, 200 microlitres de tampon de décapage dans le puits correspondant à la position du biocapteur hydraté.
Après avoir placé le tube A1 dans le support de tube, fixé le biocapteur enrobé d’appât au système BLI et glissé le tube sous le biocapteur, appuyez sur exécuter le logiciel. Une fois l’étape de référence initiale terminée, ouvrez le couvercle et ajoutez quatre microlitres de tampon BLI dans le support de goutte. Faites glisser le support de goutte sous le biocapteur et surveillez l’étape d’association sur l’interface BLI.
Remplacez le tube A1 par le tube D1. Glissez-le sous le biocapteur et fermez le couvercle. Surveillez ensuite l’étape de dissociation sur l’interface BLI. Une fois l’étape de dissociation terminée, ouvrez le couvercle, retirez le biocapteur et replacez-le dans son bac contenant le tampon BLI.
Fixez ensuite le biocapteur recouvert d’appât et placez le tube A2 dans le support de tube. Faites glisser le tube sous le biocapteur et cliquez sur Exécuter dans le logiciel. Après l’étape de base, ajoutez quatre microlitres de RPA à cinq nanomolaires sur le support de goutte.
Faites glisser le support de goutte sous le biocapteur et fermez le couvercle. Surveillez la courbe d’association sur l’interface du logiciel. Retirez le biocapteur et plongez-le dans le tampon de décapage pendant 30 secondes.
Plongez ensuite le biocapteur dans le tampon BLI pendant trois minutes. Dans le tableau intitulé Liste d’exécution, cochez la case référence pour la concentration de l’analyte de zéro nanomolaire pour servir de courbe de référence, cochez la case analyser, pour toutes les concentrations de l’analyte. Sélectionnez à la fois le début de l’association et le début de la dissociation pour la correction d’étape, choisissez l’ajustement global pour le test.
Ensuite, cliquez sur analyser pour traiter les données. Pour exporter les données ajustées, faites un clic droit sur le graphique généré à partir des données d’analyse. Sélectionnez Exporter les données, puis choisissez du texte ou des données, cliquez sur fichier, puis naviguez pour enregistrer les données au format DAT.
Ouvrez le logiciel et sélectionnez cinétique avancée dans le panneau de gauche. Après avoir placé une plaque de 96 puits dans le plateau du biocapteur et ajouté 200 microlitres de tampon BLI à cinq puits, insérez le plateau du biocapteur dans la plaque pour hydrater les capteurs. Pendant que les biocapteurs s’hydratent, pipetez 250 microlitres de tampon BLI dans 10 tubes à centrifuger noirs de 0,5 millilitre.
Remplissez les détails de l’expérience sur l’interface du logiciel et appuyez sur le bouton de calcul pour traiter les informations. Après avoir glissé le support de tube avec le tube A1 sous le biocapteur, cliquez sur exécuter pour obtenir la ligne de base initiale. Ajoutez quatre microlitres de tampon BLI dans le support de goutte.
Faites glisser le support de chute sous le biocapteur, fermez le couvercle et surveillez la courbe pour le chargement dans le logiciel. Le décalage spectral pendant la liaison RPA à l’aide de la cinétique de base a démontré une augmentation dose-dépendante de la force de liaison avec une saturation atteinte à 40 nanomolaires. Le décalage spectral lors de la liaison RPA à l’aide d’une cinétique avancée a également montré une liaison dose-dépendante, mais avec des biocapteurs individuels utilisés par concentration pour une meilleure précision.
