אינטראקציות ביומולקולות, כולל אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-דנ"א, חיוניות במחקר ביוכימי. במחקר זה אנו משתמשים באינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית, או BLI, טכניקה יעילה לניתוח אינטראקציות אלה. אנו מתמקדים בחלבון שכפול A ובזיקה הקושרת שלו לדנ"א גדיל יחיד כדי להציג את העקרונות והיכולות של BLI.
אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית היא שיטה קלה וחסכונית לחקר קינטיקה של חלבונים. הוא מאפשר ניטור מהיר בזמן אמת של אינטראקציות חלבונים ומציע זרימת עבודה פשוטה עם פחות מורכבות מאשר טכניקות אחרות. במעבדה שלנו אנו חוקרים את ההשפעה של שינויים לאחר תרגום על המבנה והתפקוד של החלבונים החיוניים לשמירה על יציבות הגנום.
שינויים אלה יכולים ליצור אפקטים מדורגים במסלולי שכפול ותיקון. על ידי חקר אינטראקציות חלבונים, אנו שואפים לחשוף את המנגנונים הבסיסיים השומרים על שלמות הגנום. כדי להתחיל, הכינו 12.5 ננו-מולר של שלושה מצעי פיתיון פולי dT 32 ראשוניים חד-גדיליים וארבעה ריכוזים של RPA באמצעות חיץ BLI.
באמצעות פיפטה, הוסף 250 מיקרוליטר של חיץ BLI בשתי שפופרות מיקרופוגה של 0.5 מיליליטר ותייג אותן כ- AND. בצלחת נפרדת של 96 בארות, פיפטה 200 מיקרוליטר של חיץ BLI בבאר אחת. מקם את מגש הביו-חיישנים על צלחת 96 הקידוחים כך שחיישן ביולוגי אחד יטבול במאגר ה-BLI.
בתוכנה, לחץ על אפשרות ההידרט והגדר את הטיימר ל -10 דקות. התאם את הגדרות ההפעלה עבור כל שלב, תוכנית בסיסית, שיוך ודיסוציאציה. הכה הפעל את התוכנה ופעל לפי ההוראות בהודעת הפקודה.
הניחו שני תאים במחזיק הצינור וחברו את הביו-חיישן הלח למערכת ה-BLI. החלק את מחזיק הצינור מתחת לחיישן הביולוגי במיקום A ונטר את קו הבסיס של הביו-חיישן. לאחר השלמת קו הבסיס הראשוני, פתח את המכסה והוסף ארבעה מיקרוליטרים של חיץ BLI למחזיק הטיפה.
החלק את מחזיק הטיפה ימינה מתחת לאותו חיישן ביולוגי במיקום B.לאחר סגירת המכסה, עקוב אחר עקומת BLI בתוכנה. לאחר מכן פתח את המכסה והחלף את צינור A בצינור D.החלק את הצינור החדש מתחת לביו-חיישן במיקום A לפני סגירת המכסה ונתח את שלב הדיסוציאציה בממשק. הכניסו את צינור A למחזיק הצינורות.
חבר את הביו-חיישן הלח למערכת BLI והחלק את מחזיק הצינור מתחת לביו-חיישן כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן לחץ על הפעל בממשק התוכנה להגדרה בסיסית. לאחר הוספת ארבעה מיקרוליטרים של פיתיון DNA חד-גדילי ננו-מולרי 12.5 ננו-מולרי למחזיק הטיפה והחלקתו מתחת לביו-חיישן לשלב האסוציאציה, עקוב אחר עקומת BLI בתוכנה.
לאחר מכן פתח את המכסה כדי להחליף את צינור A ב- D.החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי והמשך בשלב הדיסוציאציה. לאחר השלמת שלב הדיסוציאציה, פתח את המכסה ונתק את הביו-סנסור. לאחר מכן הניחו את החיישן הביולוגי במגש המכיל מאגר BLI.
באמצעות פיפטה, להוסיף 250 מיקרוליטר של חיץ BLI 10 0.5 מיליליטר שחור microfuge tubes. תייג את הצינורות כ- A1 עד A5 ו- D1 עד D5. מלא את פרטי הניסוי בממשק התוכנה ולחץ על כפתור החישוב כדי לעבד את המידע. בצלחת נפרדת של 96 באר פיפטה 200 מיקרוליטר של חיץ הפשטה לתוך הבאר המתאימה למיקום של biosensor hydrated.
לאחר הנחת צינור A1 במחזיק הצינור, חיבור הביו-חיישן המצופה בפיתיון למערכת BLI והחלקת הצינור מתחת לביו-סנסור, לחץ על הפעל בתוכנה. לאחר השלמת שלב הבסיס הראשוני, פתח את המכסה והוסף ארבעה מיקרוליטרים של מאגר BLI למחזיק הטיפה. החלק את מחזיק הטיפה מתחת לחיישן הביולוגי ונטר את שלב השיוך בממשק BLI.
החלף את צינור A1 ב- D1. החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי וסגור את המכסה. לאחר מכן עקוב אחר שלב הדיסוציאציה בממשק BLI. לאחר השלמת שלב הדיסוציאציה, פתח את המכסה, הסר את החיישן הביולוגי והחזיר אותו למגש המכיל מאגר BLI.
לאחר מכן חבר את הביוסנסור המצופה בפיתיון והנח את הצינור A2 במחזיק הצינור. החלק את הצינור מתחת לחיישן הביולוגי ולחץ על הפעל את התוכנה. לאחר שלב הבסיס, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חמישה RPA ננו-מולארי למחזיק הטיפה.
החלק את מחזיק הטיפה מתחת לחיישן הביולוגי וסגור את המכסה. עקוב אחר עקומת השיוך בממשק התוכנה. הסר את החיישן הביולוגי וטבל אותו במאגר ההפשטה למשך 30 שניות.
לאחר מכן טבלו את החיישן הביולוגי במאגר BLI למשך שלוש דקות. בטבלה שכותרתה Run List, סמן את ההפניה לתיבה עבור ריכוז האנליט של אפס ננו-מולרי שישמש כעקומת ייחוס, סמן את התיבה, נתח, עבור כל הריכוזים של האנליט. בחר גם תחילת שיוך וגם תחילת דיסוציאציה לתיקון שלבים, בחר התאמה גלובלית לבדיקה.
לאחר מכן, לחץ על נתח כדי לעבד את הנתונים. כדי לייצא את הנתונים המותאמים, לחץ לחיצה ימנית על הגרף שנוצר מנתוני הניתוח. בחר ייצוא נתונים, לאחר מכן בחר טקסט או נתונים, לחץ על קובץ ולאחר מכן עיין כדי לשמור את הנתונים בפורמט DAT.
פתח את התוכנה ובחר קינטיקה מתקדמת מהלוח השמאלי. לאחר הנחת צלחת של 96 בארות במגש הביו-סנסור והוספת 200 מיקרוליטר של חיץ BLI לחמש בארות, הכנס את מגש הביו-חיישן לצלחת כדי ללחלח את החיישנים. בזמן שהחיישנים הביולוגיים מעניקים לחות, פיפטה 250 מיקרוליטר של BLI חוצצת לתוך 10 צינורות צנטריפוגה שחורים של 0.5 מיליליטר.
מלא את פרטי הניסוי בממשק התוכנה ולחץ על כפתור החישוב כדי לעבד את המידע. לאחר החלקת מחזיק הצינור עם צינור A1 מתחת לחיישן הביולוגי, לחץ על הפעל כדי לקבל את קו הבסיס הראשוני. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חיץ BLI למחזיק הטיפה.
החלק את מחזיק הטיפה מתחת לחיישן הביולוגי, סגור את המכסה ועקוב אחר העקומה לטעינה בתוכנה. השינוי הספקטרלי במהלך קשירת RPA באמצעות קינטיקה בסיסית הדגים עלייה תלוית מינון בחוזק הקשירה עם רוויה שהושגה ב -40 ננו-טוחנת. השינוי הספקטרלי במהלך קשירת RPA באמצעות קינטיקה מתקדמת הראה באופן דומה קשירה תלוית מינון, אך עם ביו-חיישנים בודדים המשמשים לכל ריכוז לשיפור הדיוק.
