Protein-protein ve protein-DNA etkileşimlerini içeren biyomolekül etkileşimleri, biyokimya araştırmalarında esastır. Bu çalışmada, bu etkileşimleri analiz etmek için etkili bir teknik olan biyokatman interferometrisi veya BLI kullanıyoruz. BLI'nin ilkelerini ve yeteneklerini sergilemek için replikasyon proteini A'ya ve tek bir iplikli DNA için bağlanma afinitesine odaklanıyoruz.
Biyotabaka interferometrisi, protein kinetiğini incelemek için kolay ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Protein etkileşimlerinin hızlı ve gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar ve diğer tekniklerden daha az karmaşıklıkla basit bir iş akışı sunar. Laboratuvarımızda, translasyon sonrası modifikasyonların genom stabilitesini korumak için gerekli olan proteinlerin yapısı ve işlevi üzerindeki etkisini inceliyoruz.
Bu değişiklikler, çoğaltma ve onarım yolları boyunca basamaklı efektler başlatabilir. Protein etkileşimlerini inceleyerek, genom bütünlüğünü koruyan altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarmayı amaçlıyoruz. Başlamak için, BLI tamponu kullanarak 12.5 nanomolar üç ana biyo tek sarmallı poli dT 32 yem substratı ve dört konsantrasyon RPA hazırlayın.
Bir pipet kullanarak, iki adet 0,5 mililitrelik mikrofüj tüpüne 250 mikrolitre BLI tamponu ekleyin ve bunları AND olarak etiketleyin. 96 oyuklu ayrı bir plakada, bir oyukta 200 mikrolitre BLI tamponu pipetleyin. Biyosensör tepsisini, bir biyosensör BLI tamponuna daldırılacak şekilde 96 oyuklu plakaya yerleştirin.
Yazılımda, hidrat seçeneğine tıklayın ve zamanlayıcıyı 10 dakikaya ayarlayın. Her adım, taban çizgisi, ilişkilendirme ve ayrıştırma için çalıştırma ayarlarını yapın. Yazılımda çalıştır düğmesine basın ve istem mesajındaki talimatları izleyin.
Tüp tutucuya iki bölme yerleştirin ve hidratlı biyosensörü BLI sistemine takın. Tüp tutucuyu A konumunda biyosensörün altına kaydırın ve biyosensör için taban çizgisini izleyin. İlk taban çizgisini tamamladıktan sonra, kapağı açın ve damla tutucuya dört mikrolitre BLI tamponu ekleyin.
Damla tutucuyu B konumunda aynı biyosensörün altında sağa kaydırın.Kapak kapatıldıktan sonra, yazılımdaki BLI eğrisini izleyin. Ardından kapağı açın ve tüp A'yı tüp D ile değiştirin. Kapağı kapatmadan önce yeni tüpü biyosensörün altına A konumunda kaydırın ve arayüzdeki ayrışma adımını analiz edin. Tüp A'yı tüp tutucuya yerleştirin.
Hidratlı biyosensörü BLI sistemine takın ve daha önce gösterildiği gibi tüp tutucuyu biyosensörün altına kaydırın. Ardından, temel kurulum için yazılım arayüzünde çalıştır'a tıklayın. Damla tutucuya dört mikrolitre 12.5 nanomolar tek sarmallı DNA yemi ekledikten ve ilişkilendirme adımı için biyosensörün altına kaydırdıktan sonra, yazılım üzerindeki BLI eğrisini izleyin.
Ardından tüp A'yı D ile değiştirmek için kapağı açın. Biyosensörün altına kaydırın ve ayrışma adımına devam edin. Ayrıştırma adımı tamamlandıktan sonra kapağı açın ve biyosensörü ayırın. Ardından biyosensörü BLI tamponu içeren tepsiye yerleştirin.
Bir pipet kullanarak, 10 adet 0,5 mililitrelik siyah mikrofüj tüpüne 250 mikrolitre BLI tamponu ekleyin. Tüpleri A1 ila A5 ve D1 ila D5 olarak etiketleyin. Yazılım arayüzündeki deneysel detayları doldurun ve bilgileri işlemek için hesaplama düğmesine basın. Ayrı bir 96 oyuklu plaka pipetinde, hidratlı biyosensörün konumuna karşılık gelen kuyuya 200 mikrolitre sıyırma tamponu pipetleyin.
A1 tüpünü tüp tutucuya yerleştirdikten, yem kaplı biyosensörü BLI sistemine taktıktan ve tüpü biyosensörün altına kaydırdıktan sonra, yazılım üzerinde çalıştır düğmesine basın. İlk temel adım tamamlandığında, kapağı açın ve damla tutucuya dört mikrolitre BLI tamponu ekleyin. Damla tutucuyu biyosensörün altına kaydırın ve BLI arayüzündeki ilişkilendirme adımını izleyin.
A1 tüpünü D1 ile değiştirin. Biyosensörün altına kaydırın ve kapağı kapatın. Ardından BLI arayüzündeki ayrışma adımını izleyin. Ayrışma adımı tamamlandıktan sonra kapağı açın, biyosensörü çıkarın ve BLI tamponu içeren tepsisine geri yerleştirin.
Ardından yem kaplı biyosensörü takın ve A2 tüpünü tüp tutucuya yerleştirin. Tüpü biyosensörün altına kaydırın ve yazılımın üzerinde çalıştır'a tıklayın. Temel adımdan sonra, damla tutucuya dört mikrolitre beş nanomolar RPA ekleyin.
Damla tutucuyu biyosensörün altına kaydırın ve kapağı kapatın. Yazılım arayüzünde ilişkilendirme eğrisini izleyin. Biyosensörü çıkarın ve 30 saniye boyunca sıyırma tamponuna daldırın.
Ardından biyosensörü üç dakika boyunca BLI tamponuna batırın. Çalıştırma Listesi etiketli tabloda, bir referans eğrisi olarak hizmet etmek için sıfır nanomolar analit konsantrasyonu için kutu referansını işaretleyin, analitin tüm konsantrasyonları için kutuyu işaretleyin, analiz edin. Adım düzeltmesi için hem ilişkilendirme başlangıcını hem de ayrışma başlangıcını seçin, tahlil için genel uyumu seçin.
Ardından, verileri işlemek için analiz et'i tıklayın. Takılan verileri dışa aktarmak için, analiz verilerinden oluşturulan grafiğe sağ tıklayın. Verileri dışa aktar'ı seçin, ardından metin veya veri seçin, dosyaya tıklayın ve ardından verileri DAT biçiminde kaydetmek için göz atın.
Yazılımı açın ve sol panelden gelişmiş kinetiği seçin. Biyosensör tepsisine 96 oyuklu bir plaka yerleştirdikten ve beş oyuğa 200 mikrolitre BLI tamponu ekledikten sonra, sensörleri nemlendirmek için biyosensör tepsisini plakaya yerleştirin. Biyosensörler nemlendirirken, 250 mikrolitre BLI tamponunu 10 adet 0,5 mililitrelik siyah santrifüj tüpüne pipetleyin.
Yazılım arayüzündeki deneysel detayları doldurun ve bilgileri işlemek için hesaplama düğmesine basın. Tüp tutucuyu A1 tüpü ile biyosensörün altına kaydırdıktan sonra, ilk taban çizgisini elde etmek için çalıştır'a tıklayın. Damla tutucuya dört mikrolitre BLI tamponu ekleyin.
Damla tutucuyu biyosensörün altına kaydırın, kapağı kapatın ve yazılıma yükleme eğrisini izleyin. Temel kinetik kullanılarak RPA bağlanması sırasında spektral kayma, 40 nanomolar'da elde edilen doygunluk ile bağlanma kuvvetinde doza bağlı bir artış gösterdi. Gelişmiş kinetik kullanılarak RPA bağlanması sırasındaki spektral kayma benzer şekilde doza bağlı bağlanma gösterdi, ancak daha iyi doğruluk için konsantrasyon başına kullanılan bireysel biyosensörler ile.
