단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호 작용을 포함한 생체 분자 상호 작용은 생화학 연구에 필수적입니다. 이 연구에서는 이러한 상호 작용을 분석하기 위한 효율적인 기술인 생물층 간섭계(BLI)를 사용합니다. 우리는 BLI의 원리와 기능을 보여주기 위해 복제 단백질 A와 단일 가닥 DNA에 대한 결합 친화도에 초점을 맞춥니다.
생물층 간섭계(Biolayer interferometry)는 단백질 반응속도학을 연구하기 위한 쉽고 비용 효율적인 방법입니다. 이를 통해 단백질 상호 작용을 실시간으로 빠르게 모니터링할 수 있으며 다른 기술보다 복잡성이 적은 간단한 워크플로우를 제공합니다. 우리 연구실에서는 게놈 안정성을 유지하는 데 필수적인 단백질의 구조와 기능에 대한 번역 후 변형의 영향을 연구합니다.
이러한 수정은 복제 및 복구 경로 전반에 걸쳐 계단식 효과를 시작할 수 있습니다. 단백질 상호 작용을 연구함으로써 우리는 게놈 무결성을 보호하는 기본 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 합니다. 먼저 BLI 버퍼를 사용하여 12.5나노몰의 3가지 프라임 바이오 단일 가닥 폴리 dT 32 미끼 기질과 4가지 농도의 RPA를 준비합니다.
피펫을 사용하여 250ml의 BLI 버퍼를 2개의 0.5ml 마이크로분리관에 추가하고 AND로 표시합니다. 별도의 96웰 플레이트에서 하나의 웰에 200마이크로리터의 BLI 버퍼를 피펫팅합니다. 하나의 바이오센서가 BLI 버퍼에 담가도록 96웰 플레이트에 바이오센서 트레이를 배치합니다.
소프트웨어에서 수화 옵션을 클릭하고 타이머를 10분으로 설정합니다. 각 단계, 기준선, 연결 및 분리에 대한 실행 설정을 조정합니다. 소프트웨어에서 실행을 누르고 프롬프트 메시지의 지침을 따릅니다.
튜브 홀더에 두 개의 베이를 놓고 수화 바이오센서를 BLI 시스템에 부착합니다. 튜브 홀더를 위치 A의 바이오센서 아래로 밀어 넣고 바이오센서의 기준선을 모니터링합니다. 초기 기준선을 완료한 후 뚜껑을 열고 드롭 홀더에 4마이크로리터의 BLI 버퍼를 추가합니다.
드롭 홀더를 B 위치에서 동일한 바이오센서 아래 오른쪽으로 밉니다. 뚜껑이 닫히면 소프트웨어에서 BLI 곡선을 모니터링합니다. 그런 다음 뚜껑을 열고 튜브 A를 튜브 D로 교체합니다.뚜껑을 닫기 전에 위치 A의 바이오센서 아래에 있는 새 튜브를 밀어 넣고 인터페이스에서 해리 단계를 분석합니다. 튜브 A를 튜브 홀더에 넣습니다.
수화된 바이오센서를 BLI 시스템에 부착하고 앞서 그림과 같이 튜브 홀더를 바이오센서 아래로 밉니다. 그런 다음 기준선 설정을 위해 소프트웨어 인터페이스에서 실행을 클릭합니다. 12.5 나노몰 단일 가닥 DNA 미끼 4마이크로리터를 드롭 홀더에 추가하고 연관 단계를 위해 바이오센서 아래로 밀어 넣은 후 소프트웨어에서 BLI 곡선을 모니터링합니다.
그런 다음 뚜껑을 열어 튜브 A를 D로 교체하고 바이오센서 아래로 밀어 넣고 해리 단계를 진행합니다. 해리 단계가 완료되면 뚜껑을 열고 바이오센서를 분리합니다. 그런 다음 BLI 버퍼가 들어 있는 트레이에 바이오센서를 놓습니다.
피펫을 사용하여 250마이크로리터의 BLI 버퍼를 10개의 0.5밀리리터 검은색 마이크로분리관에 추가합니다. 튜브에 A1에서 A5 및 D1에서 D5로 레이블을 지정합니다. 소프트웨어 인터페이스에 실험 세부 정보를 입력하고 계산 버튼을 눌러 정보를 처리합니다. 별도의 96-웰 플레이트에서, 피펫에서, 200 마이크로리터의 스트리핑 버퍼를 수화된 바이오센서의 위치에 해당하는 웰 내로 넣는다.
튜브 홀더에 튜브 A1을 놓고 미끼 코팅된 바이오센서를 BLI 시스템에 부착하고 튜브를 바이오센서 아래로 밀어 넣은 후 소프트웨어에서 실행을 누릅니다. 초기 기준선 단계가 완료되면 뚜껑을 열고 드롭 홀더에 4마이크로리터의 BLI 버퍼를 추가합니다. 드롭 홀더를 바이오센서 아래로 밀어 넣고 BLI 인터페이스에서 연결 단계를 모니터링합니다.
튜브 A1을 D1으로 교체합니다. 바이오센서 아래로 밀어 넣고 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 BLI 인터페이스에서 분리 단계를 모니터링합니다. 해리 단계가 완료되면 뚜껑을 열고 바이오센서를 제거한 다음 BLI 버퍼가 들어 있는 트레이에 다시 넣습니다.
그런 다음 미끼로 코팅된 바이오센서를 부착하고 튜브 홀더에 튜브 A2를 놓습니다. 튜브를 바이오센서 아래로 밀어 넣고 소프트웨어에서 실행을 클릭합니다. 기준선 단계 후 4마이크로리터의 5나노몰 RPA를 드롭 홀더에 추가합니다.
드롭 홀더를 바이오센서 아래로 밀어 넣고 뚜껑을 닫습니다. 소프트웨어 인터페이스에서 연결 곡선을 모니터링합니다. 바이오센서를 제거하고 스트리핑 버퍼에 30초 동안 담그십시오.
그런 다음 바이오센서를 BLI 버퍼에 3분 동안 담그십시오. Run List(실행 목록)라고 표시된 표에서 기준 곡선으로 사용할 0 나노몰의 분석물 농도에 대한 상자 참조를 선택하고, 분석물의 모든 농도에 대해 상자를 선택하고 분석합니다. 단계 보정을 위해 association 시작과 start of dissociation을 모두 선택하고 분석에 대한 global fitting을 선택합니다.
그런 다음 분석을 클릭하여 데이터를 처리합니다. 피팅된 데이터를 내보내려면 분석 데이터에서 생성된 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오. 데이터 내보내기를 선택한 다음 텍스트 또는 데이터를 선택하고 파일을 클릭한 다음 데이터를 찾아 DAT 형식으로 저장합니다.
소프트웨어를 열고 왼쪽 패널에서 고급 동역학을 선택합니다. 96웰 플레이트를 바이오센서 트레이에 놓고 5개의 웰에 200마이크로리터의 BLI 버퍼를 추가한 후 바이오센서 트레이를 플레이트에 삽입하여 센서에 수분을 공급합니다. 바이오센서가 수분을 공급하는 동안 250마이크로리터의 BLI 버퍼를 10개의 0.5밀리리터 검은색 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다.
소프트웨어 인터페이스에 실험 세부 정보를 입력하고 계산 버튼을 눌러 정보를 처리합니다. 튜브 A1이 있는 튜브 홀더를 바이오센서 아래로 밀어 넣은 후 실행을 클릭하여 초기 기준선을 얻습니다. 4마이크로리터의 BLI 버퍼를 드롭 홀더에 추가합니다.
드롭 홀더를 바이오센서 아래로 밀고 뚜껑을 닫은 다음 소프트웨어에서 로딩을 위한 곡선을 모니터링합니다. 기본 동역학을 사용한 RPA 결합 중 스펙트럼 이동은 40나노몰에서 달성된 포화와 함께 결합 강도의 용량에 따른 증가를 보여주었습니다. 고급 동역학을 사용한 RPA 결합 중 스펙트럼 이동은 유사하게 용량 의존적 결합을 보여주었지만 정확도 향상을 위해 농도당 개별 바이오센서를 사용했습니다.
