Биомолекулярные взаимодействия, включая взаимодействие белок-белок и белок-ДНК, имеют важное значение в биохимических исследованиях. В этом исследовании мы используем биослойную интерферометрию, или BLI, эффективный метод анализа этих взаимодействий. Мы сосредоточимся на репликационном белке А и его аффинности связывания с одноцепочечной ДНК, чтобы продемонстрировать принципы и возможности BLI.
Биослойная интерферометрия является простым и экономически эффективным методом изучения кинетики белка. Он позволяет быстро отслеживать взаимодействия белков в режиме реального времени и предлагает простой рабочий процесс с меньшей сложностью, чем другие методы. В нашей лаборатории мы изучаем влияние посттрансляционных модификаций на структуру и функцию белков, которые необходимы для поддержания стабильности генома.
Эти изменения могут инициировать каскадные эффекты между путями репликации и восстановления. Изучая белковые взаимодействия, мы стремимся раскрыть основные механизмы, которые обеспечивают целостность генома. Для начала приготовьте 12,5 наномоляров из трех основных био-одноцепочечных субстратов для приманки Poly dT 32 и четырех концентраций RPA с использованием буфера BLI.
С помощью пипетки добавьте 250 микролитров буфера BLI в две пробирки с микрофугами объемом 0,5 мл и пометьте их как И. В отдельную 96-луночную пластину пипетку наберите 200 микролитров буфера BLI в одну лунку. Расположите лоток с биосенсорами на 96-луночном планшете таким образом, чтобы один биосенсор погрузился в буфер BLI.
В программном обеспечении нажмите на опцию гидратации и установите таймер на 10 минут. Настройте параметры выполнения для каждого шага, базового плана, связи и диссоциации. Нажмите кнопку «Выполнить» в программном обеспечении и следуйте инструкциям в подсказке.
Поместите два отсека в держатель трубки и прикрепите гидратированный биосенсор к системе LI. Сдвиньте держатель трубки под биосенсор в положение A и следите за базовой линией биосенсора. После завершения начального базового уровня откройте крышку и добавьте четыре микролитра буфера BLI в держатель для сброса.
Сдвиньте держатель капель вправо под тем же биосенсором в положение B. После закрытия крышки следите за кривой BLI в программном обеспечении. Затем откройте крышку и замените трубку A на трубку D. Вставьте новую трубку под биосенсор в положение A перед закрытием крышки и проанализируйте этап диссоциации в интерфейсе. Поместите трубку А в держатель трубки.
Прикрепите гидратированный биосенсор к системе BLI и сдвиньте держатель трубки под биосенсор, как показано ранее. Затем нажмите кнопку «Выполнить» в интерфейсе программного обеспечения для настройки базовых показателей. После добавления четырех микролитров 12,5 наномолярной одноцепочечной ДНК-приманки в держатель капель и поднесите ее под биосенсор для шага ассоциации, отслеживайте кривую BLI в программном обеспечении.
Затем откройте крышку, чтобы заменить пробирку А на D. Вставьте ее под биосенсор и приступайте к этапу диссоциации. После завершения этапа диссоциации откройте крышку и отсоедините биосенсор. Затем поместите биосенсор в лоток, содержащий буфер LI.
С помощью пипетки добавьте 250 микролитров буфера BLI в 10 0,5 миллилитровых черных пробирок для микрофуги. Маркируйте пробирки как A1 - A5 и D1 - D5. Заполните экспериментальные данные в интерфейсе программы и нажмите кнопку расчета для обработки информации. В отдельную 96-луночную планшетную пипетку вводят 200 микролитров отпарного буфера в лунку, соответствующую положению гидратированного биосенсора.
После помещения трубки А1 в держатель трубки, присоединения покрытого приманкой биосенсора к системе BLI и проталкивания трубки под биосенсор, нажмите на программное обеспечение. После завершения начального базового этапа откройте крышку и добавьте четыре микролитра буфера BLI в держатель для капель. Сдвиньте держатель капель под биосенсор и следите за шагом ассоциации на интерфейсе BLI.
Замените трубку A1 на D1. Вставьте его под биосенсор и закройте крышку. Затем отслеживайте шаг диссоциации в интерфейсе BLI. После завершения этапа диссоциации откройте крышку, извлеките биосенсор и поместите его обратно в лоток с буфером BLI.
Затем прикрепите биосенсор с покрытием приманкой и поместите трубку А2 в держатель трубки. Вставьте трубку под биосенсор и нажмите кнопку «Выполнить» в программном обеспечении. После базового шага добавьте четыре микролитра пяти наномолярных RPA в держатель.
Сдвиньте держатель капель под биосенсор и закройте крышку. Отслеживайте кривую ассоциации в интерфейсе программного обеспечения. Извлеките биосенсор и опустите его в буфер для отпаривания на 30 секунд.
Затем опустите биосенсор в буфер BLI на три минуты. В таблице с надписью Run List установите флажок Ссылка на концентрацию аналита нулевого наномоляра будет служить эталонной кривой, установите флажок Анализировать для всех концентраций аналита. Выберите начало ассоциации и начало диссоциации для ступенчатой коррекции, выберите глобальную подгонку для анализа.
Затем нажмите кнопку «Анализировать» для обработки данных. Чтобы экспортировать подогнанные данные, щелкните правой кнопкой мыши график, созданный на основе проанализированных данных. Выберите экспорт данных, затем выберите текст или данные, нажмите на файл, а затем перейдите к сохранению данных в формате DAT.
Откройте программу и выберите расширенную кинетику на левой панели. Поместив 96-луночный планшет в лоток для биосенсоров и добавив 200 микролитров буфера BLI в пять лунок, вставьте лоток с биосенсором в планшет для гидратации сенсоров. Пока биосенсоры увлажняются, пипеткой наберите 250 микролитров буфера BLI в 10 черных центрифужных пробирок объемом 0,5 миллилитров.
Заполните экспериментальные данные в интерфейсе программы и нажмите кнопку расчета для обработки информации. После того, как держатель пробирки с трубкой А1 подошел к биосенсору, нажмите кнопку «Выполнить», чтобы получить начальную базовую линию. Добавьте четыре микролитра буфера BLI в держатель для сбросов.
Сдвиньте держатель капель под биосенсор, закройте крышку и следите за кривой загрузки в программном обеспечении. Спектральный сдвиг при связывании RPA с использованием базовой кинетики продемонстрировал дозозависимое увеличение прочности связывания с насыщением, достигаемым при 40 наномолярах. Спектральный сдвиг во время связывания RPA с использованием усовершенствованной кинетики также показал дозозависимое связывание, но с использованием отдельных биосенсоров для каждой концентрации для повышения точности.
