タンパク質-タンパク質間およびタンパク質-DNA相互作用を含む生体分子間相互作用は、生化学研究において不可欠です。この研究では、これらの相互作用を解析するための効率的な手法であるバイオレイヤー干渉法(BLI)を使用します。私たちは、複製プロテインAとその一本鎖DNAへの結合親和性に焦点を当て、BLIの原理と能力を紹介します。
バイオレイヤーインターフェロメトリーは、タンパク質動態を研究するための簡単で費用対効果の高い方法です。これにより、タンパク質相互作用の迅速なリアルタイムモニタリングが可能になり、他の手法よりも複雑さの少ない簡単なワークフローが提供されます。私たちの研究室では、ゲノムの安定性を維持するために不可欠なタンパク質の構造と機能に対する翻訳後修飾の影響を研究しています。
これらの変更は、レプリケーションと修復の経路全体でカスケード効果を開始できます。タンパク質の相互作用を研究することで、ゲノムの完全性を守る根本的なメカニズムを明らかにすることを目指しています。まず、BLIバッファーを使用して、3つの主要なバイオ一本鎖poly dT 32ベイト基質と4つの濃度のRPAを12.5ナノモルで調製します。
ピペットを使用して、250マイクロリットルのBLIバッファーを2本の0.5ミリリットルマイクロフュージチューブに追加し、ANDとしてラベル付けします。別の96ウェルプレートに、1つのウェルに200マイクロリットルのBLIバッファーをピペットで入れます。バイオセンサーのトレイを96ウェルプレート上に配置し、1つのバイオセンサーがBLIバッファーに浸るようにします。
ソフトウェアで、ハイドレートオプションをクリックし、タイマーを10分に設定します。各ステップ、ベースライン、関連付け、および分離の実行設定を調整します。ソフトウェアで実行をクリックし、プロンプトメッセージの指示に従います。
チューブホルダーに2つのベイを配置し、水和バイオセンサーをBLIシステムに取り付けます。チューブホルダーをバイオセンサーの下のAの位置にスライドさせ、バイオセンサーのベースラインを監視します。最初のベースラインが完了したら、蓋を開けて、4マイクロリットルのBLIバッファーをドロップホルダーに追加します。
ドロップホルダーを同じバイオセンサーの下のBの位置で右にスライドさせます。蓋を閉じたら、ソフトウェアでBLI曲線を監視します。次に、蓋を開けてチューブAをチューブDと交換します。蓋を閉じる前に、新しいチューブをバイオセンサーの位置Aの下にスライドさせ、インターフェースの解離ステップを分析します。チューブAをチューブホルダーに入れます。
水和バイオセンサーをBLIシステムに取り付け、前に示すようにチューブホルダーをバイオセンサーの下にスライドさせます。次に、ソフトウェアインターフェイスで[実行]をクリックして、ベースラインセットアップを行います。4マイクロリットルの12.5ナノモル一本鎖DNAベイトをドロップホルダーに追加し、アソシエーションステップのためにバイオセンサーの下にスライドさせた後、ソフトウェアでBLI曲線を監視します。
次に、蓋を開けてチューブAをDと交換します.バイオセンサーの下にスライドさせて、解離ステップを進めます。解離ステップが完了したら、蓋を開けてバイオセンサーを取り外します。次に、BLIバッファーの入ったトレイにバイオセンサーを置きます。
ピペットを使用して、250マイクロリットルのBLIバッファーを10本の0.5ミリリットルの黒色マイクロフュージチューブに追加します。チューブにA1からA5およびD1からD5のラベルを付けます。ソフトウェアインターフェースに実験の詳細を入力し、計算ボタンを押して情報を処理します。別の96ウェルプレートピペットで、水和バイオセンサーの位置に対応するウェルにストリッピングバッファー200マイクロリットルを入れます。
チューブA1をチューブホルダーに入れ、ベイトコーティングされたバイオセンサーをBLIシステムに取り付け、チューブをバイオセンサーの下にスライドさせた後、ソフトウェアの実行を押します。最初のベースラインステップが完了したら、蓋を開けて、ドロップホルダーに4マイクロリットルのBLIバッファーを追加します。ドロップホルダーをバイオセンサーの下にスライドさせ、BLIインターフェースの関連付けステップを監視します。
チューブA1をD1と交換します。バイオセンサーの下に滑り込ませ、フタを閉めます。次に、BLI インターフェイスで分離ステップを監視します。解離ステップが完了したら、蓋を開けてバイオセンサーを取り外し、BLIバッファーの入ったトレイに戻します。
次に、餌でコーティングされたバイオセンサーを取り付け、チューブA2をチューブホルダーに入れます。チューブをバイオセンサーの下にスライドさせ、ソフトウェアの実行をクリックします。ベースラインステップの後、4マイクロリットルの5ナノモルRPAをドロップホルダーに加えます。
ドロップホルダーをバイオセンサーの下にスライドさせ、蓋を閉めます。ソフトウェアインターフェースの関連付け曲線を監視します。バイオセンサーを取り外し、ストリッピングバッファーに30秒間浸します。
次に、バイオセンサーをBLIバッファーに3分間浸します。[Run List]とラベル付けされたテーブルで、参照曲線として機能する分析物濃度のゼロナノモルの参照ボックスをオンにし、分析するすべての濃度の分析チェックボックスをオンにします。ステップ補正のために、関連付けの開始と解離の開始の両方を選択し、アッセイのグローバルフィッティングを選択します。
次に、[分析] をクリックしてデータを処理します。フィットデータをエクスポートするには、解析データから生成されたグラフを右クリックします。[データのエクスポート]を選択し、テキストまたはデータを選択し、[ファイル]をクリックして、DAT形式でデータを参照して保存します。
ソフトウェアを開き、左側のパネルから[高度な動力学]を選択します。バイオセンサートレイに96ウェルプレートを置き、5つのウェルに200マイクロリットルのBLIバッファーを追加した後、バイオセンサートレイをプレートに挿入してセンサーを水和させます。バイオセンサーが水分を補給している間に、250マイクロリットルのBLIバッファーを10本の0.5ミリリットルの黒色遠心分離管にピペットで入れます。
ソフトウェアインターフェースに実験の詳細を入力し、計算ボタンを押して情報を処理します。チューブホルダーをチューブA1でバイオセンサーの下にスライドさせた後、runをクリックして初期ベースラインを取得します。BLIバッファーの4マイクロリットルをドロップホルダーに追加します。
ドロップホルダーをバイオセンサーの下にスライドさせ、蓋を閉めて、ソフトウェアにロードするための曲線を監視します。基本動力学を用いたRPA結合中のスペクトルシフトは、40ナノモルで達成される飽和度とともに、結合強度の用量依存的な増加を示しました。高度な動力学を使用したRPA結合中のスペクトルシフトも同様に用量依存的な結合を示しましたが、精度を向上させるために濃度ごとに個別のバイオセンサーが使用されました。
