Biomolekül-Wechselwirkungen, einschließlich Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen, sind in der biochemischen Forschung unerlässlich. In dieser Studie verwenden wir die Biolayer-Interferometrie (BLI), eine effiziente Technik zur Analyse dieser Wechselwirkungen. Wir konzentrieren uns auf das Replikationsprotein A und seine Bindungsaffinität für eine Einzelstrang-DNA, um die Prinzipien und Fähigkeiten von BLI zu demonstrieren.
Die Biolayer-Interferometrie ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Untersuchung der Proteinkinetik. Es ermöglicht eine schnelle Echtzeit-Überwachung von Proteininteraktionen und bietet einen unkomplizierten Arbeitsablauf mit weniger Komplexität als andere Techniken. In unserem Labor untersuchen wir die Auswirkungen posttranslationaler Modifikationen auf die Struktur und Funktion der Proteine, die für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität unerlässlich sind.
Diese Modifikationen können kaskadierende Effekte über Replikations- und Reparaturpfade hinweg auslösen. Durch die Untersuchung von Proteininteraktionen wollen wir die zugrunde liegenden Mechanismen aufdecken, die die Integrität des Genoms gewährleisten. Bereiten Sie zunächst 12,5 Nanomolar von drei erstklassigen bio-einzelsträngigen Poly dT 32-Ködersubstraten und vier RPA-Konzentrationen unter Verwendung von BLI-Puffer vor.
Geben Sie mit einer Pipette 250 Mikroliter BLI-Puffer in zwei 0,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen und markieren Sie sie als UND. Pipettieren Sie in einer separaten 96-Well-Platte 200 Mikroliter BLI-Puffer in eine Well. Positionieren Sie das Tablett mit den Biosensoren so auf der 96-Well-Platte, dass ein Biosensor in den BLI-Puffer eintaucht.
Klicken Sie in der Software auf die Option Hydrate und stellen Sie den Timer auf 10 Minuten ein. Passen Sie die Ausführungseinstellungen für jeden Schritt, jede Baseline, jede Zuordnung und jeden Dissoziation an. Klicken Sie in der Software auf Ausführen und folgen Sie den Anweisungen in der Eingabeaufforderung.
Platzieren Sie zwei Schächte in der Röhrchenhalterung und befestigen Sie den hydratisierten Biosensor an das BLI-System. Schieben Sie den Röhrchenhalter an Position A unter den Biosensor und überwachen Sie die Ausgangslinie für den Biosensor. Öffnen Sie nach Abschluss der anfänglichen Basislinie den Deckel und geben Sie vier Mikroliter BLI-Puffer in den Tropfenhalter.
Schieben Sie den Tropfenhalter nach rechts unter denselben Biosensor an Position B.Sobald der Deckel geschlossen ist, überwachen Sie die BLI-Kurve in der Software. Öffnen Sie dann den Deckel und ersetzen Sie den Schlauch A durch den Schlauch D. Schieben Sie den neuen Schlauch unter den Biosensor an Position A, bevor Sie den Deckel schließen, und analysieren Sie den Dissoziationsschritt in der Grenzfläche. Setzen Sie den Schlauch A in den Schlauchhalter ein.
Befestigen Sie den hydratisierten Biosensor an das BLI-System und schieben Sie den Schlauchhalter wie zuvor gezeigt unter den Biosensor. Klicken Sie dann auf der Softwareoberfläche auf Ausführen, um die Basiseinrichtung zu starten. Nachdem Sie vier Mikroliter 12,5 nanomolare einzelsträngige DNA-Köder in den Tropfenhalter gegeben und für den Assoziationsschritt unter den Biosensor geschoben haben, überwachen Sie die BLI-Kurve in der Software.
Öffnen Sie dann den Deckel, um Röhrchen A durch D zu ersetzen.Schieben Sie es unter den Biosensor und fahren Sie mit dem Dissoziationsschritt fort. Sobald der Dissoziationsschritt abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel und nehmen Sie den Biosensor ab. Legen Sie dann den Biosensor in das Tablett mit dem BLI-Puffer.
Geben Sie mit einer Pipette 250 Mikroliter BLI-Puffer in 10 schwarze Mikrofuge-Röhrchen von 0,5 Millilitern. Beschriften Sie die Röhrchen als A1 bis A5 und D1 bis D5. Geben Sie die experimentellen Details auf der Softwareoberfläche ein und drücken Sie die Berechnungstaste, um die Informationen zu verarbeiten. In einer separaten 96-Well-Platte werden 200 Mikroliter Stripping-Puffer entsprechend der Position des hydratisierten Biosensors in die Vertiefung pipettiert.
Nachdem Sie den Schlauch A1 in den Schlauchhalter eingelegt haben, den köderbeschichteten Biosensor am BLI-System befestigt und den Schlauch unter den Biosensor geschoben haben, drücken Sie auf der Software auf Run. Sobald der erste Basisschritt abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel und geben Sie vier Mikroliter BLI-Puffer in den Tropfenhalter. Schieben Sie den Tropfenhalter unter den Biosensor und überwachen Sie den Assoziationsschritt auf der BLI-Schnittstelle.
Röhrchen A1 durch D1 ersetzen. Schieben Sie es unter den Biosensor und schließen Sie den Deckel. Überwachen Sie dann den Dissoziationsschritt auf der BLI-Schnittstelle. Sobald der Dissoziationsschritt abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie den Biosensor und setzen Sie ihn wieder in die Schale mit dem BLI-Puffer ein.
Befestigen Sie dann den köderbeschichteten Biosensor und legen Sie den Schlauch A2 in den Schlauchhalter. Schieben Sie das Röhrchen unter den Biosensor und klicken Sie in der Software auf Ausführen. Geben Sie nach dem Basisschritt vier Mikroliter mit fünf nanomolaren RPA auf den Tropfenhalter.
Schieben Sie den Tropfenhalter unter den Biosensor und schließen Sie den Deckel. Überwachen Sie die Assoziationskurve auf der Softwareoberfläche. Entfernen Sie den Biosensor und tauchen Sie ihn für 30 Sekunden in den Stripping-Puffer.
Tauchen Sie dann den Biosensor für drei Minuten in den BLI-Puffer. Aktivieren Sie in der Tabelle Run List das Kontrollkästchen Referenz für die Analytkonzentration von null Nanomolar, um als Referenzkurve zu dienen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Analysieren, für alle Konzentrationen des Analyten. Wählen Sie sowohl den Beginn der Assoziation als auch den Beginn der Dissoziation für die Schrittkorrektur aus, und wählen Sie die globale Anpassung für den Assay.
Klicken Sie anschließend auf Analysieren, um die Daten zu verarbeiten. Um die angepassten Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, das aus den Analysedaten generiert wurde. Wählen Sie Daten exportieren, wählen Sie dann Text oder Daten, klicken Sie auf Datei und navigieren Sie dann, um die Daten im DAT-Format zu speichern.
Öffnen Sie die Software und wählen Sie im linken Bereich die Option Erweiterte Kinetik. Nachdem Sie eine 96-Well-Platte in das Biosensor-Tray eingelegt und 200 Mikroliter BLI-Puffer in fünf Wells gegeben haben, setzen Sie das Biosensor-Tray in die Platte ein, um die Sensoren zu hydratisieren. Während die Biosensoren hydratisieren, pipettieren Sie 250 Mikroliter BLI-Puffer in 10 schwarze 0,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Geben Sie die experimentellen Details auf der Softwareoberfläche ein und drücken Sie die Berechnungstaste, um die Informationen zu verarbeiten. Nachdem Sie den Röhrchenhalter mit dem Röhrchen A1 unter den Biosensor geschoben haben, klicken Sie auf Ausführen, um die anfängliche Ausgangsbasis zu erhalten. Geben Sie vier Mikroliter des BLI-Puffers in den Tropfenhalter.
Schieben Sie den Tropfenhalter unter den Biosensor, schließen Sie den Deckel und überwachen Sie die Kurve für das Laden in der Software. Die spektrale Verschiebung während der RPA-Bindung unter Verwendung grundlegender Kinetik zeigte eine dosisabhängige Zunahme der Bindungsstärke mit einer Sättigung, die bei 40 Nanomolar erreicht wurde. Die spektrale Verschiebung während der RPA-Bindung unter Verwendung fortschrittlicher Kinetik zeigte ebenfalls eine dosisabhängige Bindung, jedoch mit individuellen Biosensoren, die pro Konzentration verwendet wurden, um die Genauigkeit zu verbessern.
