توفر هذه الدراسة بروتوكولا قياسيا لدراسة تمايز خلايا Th17 ، وهي مجموعة فرعية من الخلايا التائية المساعدة التي تلعب دورا رئيسيا في الاستجابات المناعية. من خلال نقل الفيروسات القهقرية للحمض النووي الريبي الموجه إلى الخلايا التائية الأولية من الفئران المعدلة وراثيا Cas9 ، يمكن للعلماء دراسة الوظيفة الخاصة للجينات في تنظيم تمايز Th17. تستخدم هذه الدراسة تقنية CRISPR-Cas9 لتحرير الجينات بدقة وتستخدم نقل الفيروسات القهقرية لاستهداف جينات معينة بكفاءة في الخلايا التائية الأولية.
يستخدم قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة التنبيغ ومراقبة تمايز الخلايا. يتم إجراء استقطابات Th17 في المختبر لتحفيز تمايز خلايا CT4 + T. يهدف بحثنا إلى سد الفجوات في فهم كيفية تنظيم جينات معينة لتمايز Th17.
نحن نستخدم CRISPR-Cas9 جنبا إلى جنب مع نقل الفيروسات القهقرية ، والذي يوفر بديلا أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة لنماذج الماوس التقليدية بالضربة القاضية. لا يفصل بروتوكولنا نقل الفيروسات القهقرية لخلايا CD4 T فحسب ، بل يوفر أيضا دليلا شاملا حول تسلسل sgRNA التدريبي وبناء البلازميدات ، والتي يتم تجاهلها في البروتوكولات الأخرى. توضح هذه الورقة كل خطوة من خطوات العملية التجريبية ، مما يضمن أن الباحثين الآخرين يمكنهم تكرار المنهجية بسهولة.
للبدء ، استخدم أداة CRISPick لتصميم الحمض النووي الريبي المرجعي الفردي لضربة قاضية ROR Gamma T. اضبط الجينوم المرجعي على Mouse GRCM 38 ، وحدد تسلسل PAM ك NGG ، بناء على نظام دليل CRISPRko. أدخل اسم الجين الهدف في مربع البحث أسفل عمود البحث السريع عن الجينات.
تحقق من أن النظام يعرض معرف الجين الصحيح والاسم الكامل للجين المستهدف لضمان التحديد الدقيق. اختر RNA دليلا واحدا مستهدفا على تسلسل RORC بناء على ترتيب الترتيب المجمعة المرتفعة وترتيب الاختيار لتقليل التطابقات خارج الهدف وزيادة الفعالية على الهدف. حدد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الدليل غير المستهدف من مكتبات Mouse Gecko V2.
تضخيم الدليل الفردي RORC وتسلسلات الترميز غير المستهدفة ذات الدليل الفردي باستخدام بوليميراز الحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات مصممة لمناطق الحمض النووي الريبي الفردي وتسلسل المتجه. استنساخ التسلسلات المضخمة في متجه PMXU 6MCS ، ووضعها بين محفز U6 وسقالة الحمض النووي الريبي الإرشادية في الإطار باستخدام بروتين الفلورسنت mChery. ثم قم بإعداد برنامج PCR لبناء المتواقل.
قبل يوم واحد من التعدي ، قم بالبذور حوالي ثمانية أضعاف 10 إلى قوة ست خلايا Plat-E في طبق 10 سم يحتوي على DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء. قبل ساعة واحدة من التعدي ، استبدل وسط زراعة الخلايا بثمانية ملليلتر من وسط المصل الدافئ المختزل بدون الفينول الأحمر ، الذي يحتوي على 5٪ FBS ، ولكن بدون البنسلين أو الستربتومايسين.
تحضير خلط التعداء 1 ، واخلط 2. قطرة قطرة ، أضف المزيج 2 إلى Mix 1 ، واخلطه برفق. احتضن الخليط لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند 20 إلى 25 درجة مئوية.
أثناء تحريك اللوحة برفق ، أضف خليط التعداء قطرة قطرة إلى خلايا Plat-E. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست إلى اثنتي عشرة ساعة. بعد الحضانة ، استبدل الوسط ب 10 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الطازجة واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
تقييم كفاءة التعدي في خلايا Plat-E عن طريق الكشف عن علامة ناقل الفيروسات القهقرية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للطافي المزراعي المحتوي على الفيروس عند 1 ، 500 جم لمدة 10 دقائق لإزالة شظايا الخلايا. قم بتقسيم المادة الطافية المحتوية على الفيروس في قارورة سعة مليلتر واحد.
للبدء ، قم بتغطية كل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا بميكروغرامين لكل ملليلتر من Anti CD3 Epsilon وأربعة ميكروغرامات لكل مليلتر من Anti CD28 في 500 ميكرولتر من PBS. لف الطبق في بارافيلم واحتضنه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد حصاد طحال الفأر ، قم بطحنه في مخزن مؤقت FACS باستخدام زجاج أرضي معقم لتجانس الأنسجة في معلق خلية واحدة.
قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل. قم بتدوير معلق خلية الطحال عند 800 جم لمدة خمس دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الحمراء. اتركي الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
ثم أضف المخزن المؤقت FACS للوصول إلى الحجم الإجمالي 15 ملليلترا. بعد الطرد المركزي ، قم بإعادة تعليق خلايا الطحال في المخزن المؤقت FACS وقم بترشيحها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. اضبط الحجم النهائي على مليلتر واحد باستخدام المخزن المؤقت FACS وعزل خلايا CD4 + T باستخدام مجموعات الكاشف التجارية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
قم بتسمية خلايا CD4 + T بخليط الأجسام المضادة الفلورية. بعد غسل الخلايا الملطخة باستخدام FACS ، قم بعزل خلايا CD4 + T الساذجة باستخدام فارز خلايا التدفق. الآن ، بعد إزالة المادة الطافية للتحفيز المرتبط باللوحة ، اشطف كل بئر من صفيحة 24 بئرا مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS.
صفيحة واحدة في 10 إلى قوة ست خلايا CD4 + T ساذجة في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية في كل بئر وتحتضن لمدة 18 إلى 24 ساعة. في اليوم التالي ، اجمع الخلايا المنشطة في أنابيب سعة 1.5 مليلتر ، وأجهزة الطرد المركزي عند 800 جرام لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من خليط العدوى ، وأضف ملليلترا واحدا من الخليط في آبار صفيحة 48 بئر.
لف اللوحة ب Parafilm ، وجهاز الطرد المركزي على ارتفاع 800 جم لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية ، مع ضبط التسارع والتباطؤ عند ثلاثة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة البارافيلم واحتضان الخلايا لمدة أربع ساعات. لتحضير الخلايا العارضة للمستضد ، أو APC ، قم بتعليق خلايا الطحال في ملليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية الذي يحتوي على 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الميتومايسين في أنبوب سعة 15 ملليلترا.
احتضان خلايا الطحال عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف PBS إلى علامة 15 مليلتر وجهاز الطرد المركزي عند 800 جرام لمدة خمس دقائق. أعد تعليق خلايا الطحال في ملليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية ، واحسب رقم الخلية على آلة عداد الخلايا.
بعد الإصابة بالفيروسات القهقرية ، قم بالطرد المركزي لخلايا CD4 + T المنقولة في أنابيب سعة 1.5 مليلتر ، وأعد تعليق الخلايا المصابة في 600 ميكرولتر من PBS. ضع 0.5 في 10 إلى قوة ست خلايا CD4 + T المنقولة في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية مع 1.5 في 10 إلى قوة ست خلايا APC في بئر من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا. مكمل مع ميكروغرامين لكل مليلتر من Anti CD3 Epsilon ، وميكروغرامين لكل مليلتر من Anti CD28 ، وكوكتيل تمايز Th17.
استزراع الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية في أنابيب سعة 1.5 مليلتر وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية الذي يحتوي على ثلاثة نانوغرام لكل مليلتر من TGF Beta و 30 نانوغرام لكل مليلتر من الإنترلوكين 6. انقل الخلايا إلى آبار صفيحة مكونة من 24 بئرا لمدة يومين.
عالج الخلايا المتمايزة ب 50 نانوغرام لكل مليلتر من PMA ، و 500 نانوغرام لكل مليلتر من الأيونومايسين ، وخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من بريفيلدين أ في 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية في بئر جديد من صفيحة 24 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. اجمع الخلايا المعالجة في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على مليلتر واحد من محلول FACS.
بعد الطرد المركزي ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام PBS الذي يحتوي على خليط من الأجسام المضادة الفلورية عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا الملطخة ب 300 ميكرولتر من PBS قبل تثبيتها ب 300 ميكرولتر من الفورمالديهايد المخزن 2٪ من الفوسفات عند أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، أعد تعليقها في 600 ميكرولتر من عازلة النفاذية والطرد المركزي عند 800 جرام لمدة خمس دقائق.
قم بتلطيخ الخلايا بجسم مضاد مضاد للإنترلوكين 17A في 100 ميكرولتر من مخزن النفاذية لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كانت كفاءة العدوى الفيروسية القهقرية ، كما هو موضح في الخلايا الإيجابية mCherry ، حوالي 40٪ ، وقد انخفضت كفاءة التمايز Th17 بشكل كبير في الخلايا المعالجة بالحمض النووي الريبي الفردي الذي يستهدف جين ROR Gamma T. انخفضت مستويات التعبير عن RORC و interleukin 17A بشكل كبير في الخلايا المعالجة بدليل واحد RNA RORC.
