מחקר זה מספק פרוטוקול סטנדרטי לחקר ההתמיינות של תאי Th17, תת-קבוצה של תאי T עוזרים הממלאים תפקיד מפתח בתגובות חיסוניות. באמצעות טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של רנ"א מנחה לתאי T ראשוניים מעכברים טרנסגניים Cas9, מדענים יכולים לחקור את התפקיד המסוים של הגנים בוויסות התמיינות Th17. מחקר זה משתמש בטכנולוגיית CRISPR-Cas9 לעריכה מדויקת של גנים ומשתמש בטרנסדוקציה רטרו-ויראלית כדי להתמקד ביעילות בגנים ספציפיים בתאי T ראשוניים.
ציטומטריית זרימה משמשת להערכת יעילות ההעברה ולניטור התמיינות תאים. קיטוב Th17 במבחנה מתבצע כדי לעורר את ההתמיינות של תאי CT4+T. המחקר שלנו נועד למלא את הפערים בהבנה של האופן שבו גנים מסוימים מווסתים את התמיינות Th17.
אנו משתמשים ב- CRISPR-Cas9 יחד עם התמרה רטרו-ויראלית, המציעה חלופה מהירה וחסכונית יותר לדגמי עכבר נוקאאוט מסורתיים. הפרוטוקול שלנו לא רק מפרט את הטרנסדוקציה הרטרו-ויראלית של תאי CD4 T, אלא גם מספק מדריך מקיף על רצפי sgRNA לאימון שלנו ובניית פלסמידים, אשר מתעלמים ממנו בפרוטוקולים אחרים. מאמר זה מתאר כל שלב בתהליך הניסוי, ומבטיח שחוקרים אחרים יוכלו לשכפל בקלות את המתודולוגיה.
כדי להתחיל, השתמש בכלי CRISPick כדי לעצב את RNA מדריך יחיד עבור ROR Gamma T knockout. הגדר את גנום הייחוס לעכבר GRCM 38, וציין את רצף PAM כ- NGG, בהתבסס על מערכת ההנחיה CRISPRko. הזן את שם גן היעד בתיבת החיפוש תחת העמודה בדיקת מידע מהירה של גנים.
ודא שהמערכת מציגה את מזהה הגן הנכון ואת השם המלא של גן היעד כדי להבטיח בחירה מדויקת. בחר RNA מדריך יחיד הממוקד ברצף RORC בהתבסס על הדירוג המשולב הגבוה וסדר הבחירה כדי למזער התאמות מחוץ למטרה ולהגדיל את יעילות המטרה. בחר את רצף הרנ"א המנחה היחיד שאינו מיועד מתוך ספריות Mouse Gecko V2.
הגבירו את רצף ה-RORC של המדריך היחיד ואת רצפי הקידוד ללא מטרה באמצעות DNA פולימראז ב-PCR עם פריימרים המיועדים לאזורי ה-RNA המנחה היחיד ורצפי הווקטור. שכפלו את הרצפים המוגברים לווקטור PMXU 6MCS, והציבו אותם בין מקדם U6 לבין פיגום הרנ"א המנחה במסגרת עם החלבון הפלואורסצנטי mCherry. לאחר מכן הגדר תוכנית PCR לבנייה וקטורית.
יום אחד לפני הטרנספקציה, זרעו בערך שמונה פעמים 10 בחזקת שישה תאי Plat-E בצלחת של 10 ס"מ המכילה DMEM בתוספת 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני עד שהתאים מגיעים ל-80% התמזגות. שעה לפני הטרנספקציה, החליפו את מדיום תרבית התאים בשמונה מיליליטר של מדיום סרום מופחת חם ללא פנול אדום, המכיל 5% FBS, אך ללא פניצילין או סטרפטומיצין.
מכינים את הטרנספקציה מערבבים 1, ומערבבים 2. טיפה אחר טיפה, מוסיפים את ערבוב 2 לערבוב 1 ומערבבים בעדינות. לדגור על התערובת במשך 15 עד 20 דקות ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס.
תוך כדי ערבול עדין של הצלחת, מוסיפים את תערובת הטרנספקציה טיפה אחר טיפה לתאי Plat-E. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שש עד שתים עשרה שעות. לאחר הדגירה, יש להחליף את המדיום ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים טרייה ולהמשיך לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות.
הערך את יעילות הטרנספקציה בתאי Plat-E על ידי זיהוי התג הווקטורי הרטרו-ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, צנטריפוגו את התרבית המכילה וירוס supernatant ב 1, 500G במשך 10 דקות כדי להסיר שברי תאים. Aliquot supernatant המכיל וירוס לתוך בקבוקונים אחד מיליליטר.
כדי להתחיל, לצפות כל באר של צלחת תרבית תאים 24 בארות עם שני מיקרוגרם למיליליטר של Anti CD3 אפסילון וארבעה מיקרוגרם למיליליטר של Anti CD28 ב 500 מיקרוליטר של PBS. עוטפים את הצלחת בפרפילם ודגרים בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך הלילה. לאחר קצירת הטחול של העכבר, טחנו אותו בחיץ FACS באמצעות זכוכית טחונה מעוקרת כדי להפוך את הרקמה לתרחיף של תא בודד.
סננו את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר. סובבו את מתלה התא הטפלני ב-800G למשך חמש דקות, והשעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטרים של חיץ ליזה של תאים אדומים. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר מכן הוסף מאגר FACS כדי להגיע לנפח כולל של 15 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, השהה מחדש את הטחול במאגר FACS וסנן אותם דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. כוונן את עוצמת הקול הסופית למיליליטר אחד באמצעות מאגר FACS ובודד את תאי CD4+T באמצעות ערכות מגיבים מסחריות, בהתאם להוראות היצרן.
תייגו את תאי CD4+T בתערובת נוגדנים פלואורסצנטיים. לאחר שטיפת התאים המוכתמים עם מאגר FACS, בודד את תאי CD4+T התמימים באמצעות ממיין תאי זרימה. כעת, לאחר הסרת הסופרנטנט של גירוי הקשור לצלחת, שטפו כל באר של צלחת בת 24 בארות פעמיים עם 500 מיקרוליטר של PBS.
צלחת אחת פי 10 בחזקת שישה תאי CD4+T נאיביים במיליליטר אחד של מדיום תרבית לימפוציטים בכל באר ודגרה במשך 18 עד 24 שעות. למחרת, אספו תאים פעילים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 800G במשך חמש דקות. מרחפים מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של תערובת הזיהום, ומוסיפים מיליליטר אחד מהתערובת לבארות של צלחת 48 בארות.
עוטפים את הצלחת בפרפילם, וצנטריפוגה ב-800 גרם למשך 90 דקות ב-32 מעלות צלזיוס, כאשר התאוצה וההאטה נקבעות על שלוש. לאחר הצנטריפוגה, להסיר את Parafilm ולדגור על התאים במשך ארבע שעות. כדי להכין תאים מציגי אנטיגן, או APC, להשעות מחדש את הטחול במיליליטר אחד של מדיום תרבית לימפוציטים המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר של מיטומיצין בצינור 15 מיליליטר.
לדגור על טחול ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסף PBS לסימן 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 800G למשך חמש דקות. השהה מחדש את הטחול במיליליטר אחד של מדיום תרבית לימפוציטים, וספור את מספר התא במכונת מונה תאים.
לאחר זיהום רטרו-ויראלי, צנטריפוגה את תאי CD4+T המומרים בצינורות של 1.5 מיליליטר, והשהתה מחדש את התאים הנגועים ב-600 מיקרוליטר של PBS. מניחים 0.5 כפול 10 בחזקת שישה תאי CD4+T מומרים במיליליטר אחד של תווך תרבית לימפוציטים עם 1.5 כפול 10 בחזקת שישה תאי APC בבאר של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות. תוסף עם שני מיקרוגרם למיליליטר של Anti CD3 Epsilon, שני מיקרוגרם למיליליטר של Anti CD28, וקוקטייל בידול Th17.
תרבית את התאים במשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר יומיים, צנטריפוגו את תרחיף התא בצינורות 1.5 מיליליטר והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבית לימפוציטים המכיל שלושה ננוגרם למיליליטר TGF Beta ו-30 ננוגרם למיליליטר אינטרלוקין 6. מעבירים את התאים לבארות של צלחת בת 24 בארות למשך יומיים.
טפל בתאים המובחנים עם 50 ננוגרם למיליליטר PMA, 500 ננוגרם למיליליטר יונומיצין, וחמישה מיקרוגרם למיליליטר ברפלדן A ב 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לימפוציטים בבאר חדשה של צלחת 24 בארות. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. אסוף את התאים המטופלים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר המכילים מיליליטר אחד של חיץ FACS.
לאחר הצנטריפוגה, מכתימים את התאים עם PBS המכיל תערובת נוגדנים פלואורסצנטית בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפו את התאים המוכתמים עם 300 מיקרוליטר PBS לפני שתיקנו אותם עם 300 מיקרוליטר של פורמלדהיד חוצץ 2% פוספט בארבע מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר שטיפת התאים עם PBS, להשעות אותם מחדש 600 מיקרוליטר של חיץ חדירה וצנטריפוגה ב 800G במשך חמש דקות.
מכתימים את התאים עם נוגדן אנטי אינטרלוקין 17A ב 100 מיקרוליטר של חיץ permeabilization במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. יעילות ההדבקה הרטרו-ויראלית, כפי שצוין על ידי תאים חיוביים mCherry, הייתה כ-40% יעילות התמיינות Th17 הופחתה משמעותית בתאים שטופלו ב-RNA מנחה יחיד המכוון לגן ROR Gamma T. רמות הביטוי של RORC ואינטרלוקין 17A ירדו באופן משמעותי בתאים שטופלו ב-RNA מנחה יחיד RORC.
