Это исследование представляет собой стандартный протокол для изучения дифференцировки клеток Th17, подмножества Т-хелперов, которые играют ключевую роль в иммунных реакциях. Посредством ретровирусной трансдукции направляющей РНК в первичные Т-клетки от трансгенных мышей Cas9 ученые могут изучить особую функцию генов в регуляции дифференцировки Th17. В этом исследовании используется технология CRISPR-Cas9 для точного редактирования генов и ретровирусная трансдукция для эффективного нацеливания на конкретные гены в первичных Т-клетках.
Проточная цитометрия используется для оценки эффективности трансдукции и мониторинга дифференцировки клеток. Поляризация Th17 in vitro проводится для стимуляции дифференцировки CT4+T-клеток. Наше исследование направлено на то, чтобы заполнить пробелы в понимании того, как конкретные гены регулируют дифференцировку Th17.
Мы используем CRISPR-Cas9 вместе с ретровирусной трансдукцией, которая предлагает более быструю и экономичную альтернативу традиционным моделям мышей с нокаутом. Наш протокол не только подробно описывает ретровирусную трансдукцию CD4 Т-клеток, но и предоставляет исчерпывающее руководство по обучению последовательностям sgRNA и построению плазмид, которое упускается из виду в других протоколах. В этой статье описывается каждый этап экспериментального процесса, гарантируя, что другие исследователи могут легко воспроизвести методологию.
Для начала используйте инструмент CRISPick для создания одиночной направляющей РНК для нокаута ROR Gamma T. Установите референсный геном на Mouse GRCM 38 и укажите последовательность PAM как NGG на основе системы направляющих CRISPRko. Введите имя целевого гена в поле поиска в столбце «Быстрый поиск генов».
Убедитесь, что система отображает правильный идентификатор гена и полное название целевого гена, чтобы обеспечить точный выбор. Выберите одну единственную направляющую РНК, нацеленную на последовательность RORC, на основе высокого комбинированного ранга и порядка выбора, чтобы свести к минимуму нецелевые совпадения и повысить эффективность на цели. Выберите нецелевую последовательность одиночной направляющей РНК из библиотек Mouse Gecko V2.
Амплифицируйте однонаправляющие RORC и однонаправляющие нецелевые кодирующие последовательности с использованием ДНК-полимеразы в ПЦР с праймерами, предназначенными для областей одиночной направляющей РНК и векторной последовательности. Клонируйте амплифицированные последовательности в вектор PMXU 6MCS, поместив их между промотором U6 и каркасом направляющей РНК в рамке с флуоресцентным белком mCherry. Затем настройте программу ПЦР для векторного построения.
За сутки до трансфекции засейте примерно восемь раз по 10 в степени шести Plat-E клеток в 10-сантиметровой чашке, содержащей DMEM с добавлением 10% FBS, пенициллина и стрептомицина. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа до тех пор, пока клетки не достигнут 80% конфлюенции. За час до трансфекции замените среду для культивирования клеток восемью миллилитрами теплой восстановленной сывороточной среды без фенолового красного, содержащей 5% FBS, но без пенициллина или стрептомицина.
Приготовьте трансфекцию Смесь 1 и Смесь 2. Капля за каплей, добавьте Смесь 2 к Смесь 1 и аккуратно перемешайте. Выдерживайте смесь от 15 до 20 минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия.
Аккуратно поворачивая пластину, добавляйте трансфекционную смесь по каплям в ячейки Plat-E. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение шести-двенадцати часов. После инкубации замените среду 10 миллилитрами свежей среды для культивирования клеток и продолжайте инкубацию при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов.
Оценка эффективности трансфекции в клетках Plat-E путем детектирования метки ретровирусного вектора с помощью флуоресцентной микроскопии. Далее центрифугируют вируссодержащую надосадочную жидкость культуры при 1,500G в течение 10 минут для удаления фрагментов клеток. Разложите вирусосодержащую надосадочную жидкость по одному миллилитру флаконов.
Для начала покройте каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования клеток двумя микрограммами на миллилитр Anti CD3 Epsilon и четырьмя микрограммами на миллилитр Anti CD28 в 500 микролитрах PBS. Оберните тарелку парапленкой и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. После сбора селезенки мыши измельчите ее в буфере FACS с использованием стерилизованного матового стекла для гомогенизации ткани в одноклеточную суспензию.
Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 микрометров в 50-миллилитровую пробирку. Вращайте суспензию селезеночных клеток при температуре 800G в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов. Дайте смеси настояться при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем добавьте буфер FACS, чтобы получить общий объем 15 миллилитров. После центрифугирования ресуспендируйте спленоциты в буфере FACS и отфильтруйте их через клеточный сетчатый фильтр с плотностью 40 микрометров. Отрегулируйте окончательный объем до одного миллилитра с помощью буфера FACS и изолируйте CD4+T-клетки с помощью коммерческих наборов реагентов, следуя инструкциям производителя.
Пометьте CD4+Т-клетки смесью флуоресцентных антител. После промывки окрашенных клеток буфером FACS изолируйте наивные CD4+Т-клетки с помощью проточного сортировщика. Теперь, после удаления надосадочной жидкости, связанной с планшетом, дважды промойте каждую лунку 24-луночного планшета 500 микролитрами PBS.
Положите один раз по 10 в степени шести наивных CD4+Т-клеток в один миллилитр питательной среды лимфоцитов в каждую лунку и инкубируйте от 18 до 24 часов. На следующий день соберите активированные клетки в пробирки объемом 1,5 миллилитра, и центрифугируйте при 800G в течение пяти минут. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре инфекционной смеси и добавьте один миллилитр смеси в лунки 48-луночного планшета.
Оберните пластину парапленкой и центрифугируйте при температуре 800G в течение 90 минут при 32 градусах Цельсия, при этом ускорение и замедление установлены на три градуса. После центрифугирования удалите парапленку и инкубируйте клетки в течение четырех часов. Для получения антигенпрезентирующих клеток, или АПК, ресуспендируют спленоциты в одном миллилитре питательной среды лимфоцитов, содержащей 50 мкг митомицина на миллилитр в 15-миллилитровой пробирке.
Инкубируйте спленоциты при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение одного часа. Далее добавьте PBS до отметки 15 миллилитров и центрифугируйте при 800G в течение пяти минут. Ресуспендируйте спленоциты в одном миллилитре питательной среды для лимфоцитов и подсчитайте количество клеток на клеточном счетчике.
После ретровирусной инфекции центрифугируйте трансдуцированные CD4+Т-клетки в пробирках объемом 1,5 миллилитра и ресуспендируйте инфицированные клетки в 600 микролитрах PBS. Поместите 0,5 умножить на 10 в степени шести трансдуцированных CD4+Т-клеток в один миллилитр питательной среды лимфоцитов и в 1,5 умножить на 10 в степени шести АПК-клеток в лунку 24-луночного клеточного культурального планшета. Добавка содержит два микрограмма на миллилитр Anti CD3 Epsilon, два микрограмма на миллилитр Anti CD28 и коктейль для дифференцировки Th17.
Культивируйте клетки в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Через двое суток центрифугируют клеточную суспензию в пробирках объемом 1,5 миллилитра и ресуспендируют гранулу в одном миллилитре питательной среды лимфоцитов, содержащей три нанограмма на миллилитр TGF Beta и 30 нанограмм на миллилитр интерлейкина 6. Переложите ячейки в лунки 24-луночной пластины на двое суток.
Обрабатывайте дифференцированные клетки 50 нанограммами на миллилитр ФМА, 500 нанограммами на миллилитр иономицина и пятью микрограммами на миллилитр брефельдена А в 500 микролитрах питательной среды лимфоцитов в новой лунке 24-луночного планшета. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. Соберите обработанные клетки в пробирки объемом 1,5 миллилитра, содержащие один миллилитр буфера FACS.
После центрифугирования окрашивайте клетки PBS, содержащим смесь флуоресцентных антител, при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. Промойте окрашенные клетки 300 микролитрами PBS перед фиксацией 300 микролитрами 2%-ного фосфатного буферного формальдегида при четырех градусах Цельсия в течение 60 минут. После промывки клеток PBS повторно суспендируйте их в 600 микролитрах буфера для пермеабилизации и центрифугируйте при 800G в течение пяти минут.
Окрашивают клетки антителом к интерлейкину 17А в 100 микролитрах пермеабилизационного буфера в течение 60 минут при комнатной температуре. Эффективность ретровирусной инфекции, на которую указывают mCherry положительные клетки, составила примерно 40%. Эффективность дифференцировки Th17 была значительно снижена в клетках, обработанных одной направляющей РНК, нацеленной на ген ROR Gamma T. Уровни экспрессии RORC и интерлейкина 17А были существенно снижены в клетках, обработанных одной направляющей РНК RORC.
