Cette étude fournit un protocole standard pour étudier la différenciation des cellules Th17, un sous-ensemble de cellules T auxiliaires qui jouent un rôle clé dans les réponses immunitaires. Grâce à la transduction rétrovirale de l’ARN guide dans les lymphocytes T primaires de souris transgéniques Cas9, les scientifiques peuvent étudier la fonction particulière des gènes dans la régulation de la différenciation Th17. Cette étude utilise la technologie CRISPR-Cas9 pour une édition précise des gènes et a utilisé la transduction rétrovirale pour cibler efficacement des gènes spécifiques dans les lymphocytes T primaires.
La cytométrie en flux est utilisée pour évaluer l’efficacité de la transduction et surveiller la différenciation cellulaire. Des polarisations Th17 in vitro sont réalisées pour stimuler la différenciation des cellules CT4+T. Notre recherche vise à combler les lacunes dans la compréhension de la façon dont des gènes spécifiques régulent la différenciation Th17.
Nous utilisons CRISPR-Cas9 avec la transduction rétrovirale, qui offre une alternative plus rapide et plus rentable aux modèles murins knock-out traditionnels. Notre protocole détaille non seulement la transduction rétrovirale des lymphocytes T CD4, mais fournit également un guide complet sur nos séquences d’entraînement d’ARNg et la construction de plasmides, ce qui est négligé dans d’autres protocoles. Cet article décrit chaque étape du processus expérimental, en veillant à ce que d’autres chercheurs puissent facilement reproduire la méthodologie.
Pour commencer, utilisez l’outil CRISPick pour concevoir l’ARN guide unique pour l’inactivation ROR Gamma T. Définissez le génome de référence sur GRCM 38 de souris et spécifiez la séquence PAM en NGG, sur la base du système de guidage CRISPRko. Entrez le nom du gène cible dans la zone de recherche sous la colonne Recherche rapide de gènes.
Vérifiez que le système affiche l’ID de gène correct et le nom complet du gène cible pour assurer une sélection précise. Choisissez un seul ARN guide ciblé sur la séquence RORC en fonction du rang combiné élevé et de l’ordre de sélection afin de minimiser les correspondances hors cible et d’augmenter l’efficacité sur la cible. Sélectionnez la séquence d’ARN guide unique non ciblée dans les banques Mouse Gecko V2.
Amplifiez les séquences codantes RORC et non cibles à guide unique à l’aide de l’ADN polymérase dans une PCR avec des amorces conçues pour les régions de séquence d’ARN guide unique et de séquence vectorielle. Clonez les séquences amplifiées dans le vecteur PMXU 6MCS, en les plaçant entre le promoteur U6 et l’échafaudage d’ARN guide dans le cadre avec la protéine fluorescente mCherry. Ensuite, mettez en place un programme PCR pour la construction vectorielle.
Un jour avant la transfection, ensemencez environ huit fois 10 à la puissance de six cellules Plat-E dans une boîte de 10 centimètres contenant du DMEM complété par 10 % de FBS, de la pénicilline et de la streptomycine. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence. Une heure avant la transfection, remplacez le milieu de culture cellulaire par huit millilitres de milieu sérique réduit chaud sans rouge de phénol, contenant 5 % de FBS, mais pas de pénicilline ni de streptomycine.
Préparez la transfection Mixez 1 et mixez 2. Goutte à goutte, ajoutez le mélange 2 au mélange 1 et mélangez délicatement. Incuber le mélange pendant 15 à 20 minutes à 20 à 25 degrés Celsius.
Tout en remuant doucement la plaque, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules Plat-E. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant six à douze heures. Après l’incubation, remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu de culture cellulaire frais et poursuivez l’incubation à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
Évaluez l’efficacité de la transfection dans les cellules Plat-E en détectant l’étiquette du vecteur rétroviral à l’aide de la microscopie à fluorescence. Ensuite, centrifugez le surnageant de culture contenant le virus à 1,500G pendant 10 minutes pour éliminer les fragments cellulaires. Aliquote le surnageant contenant le virus dans des flacons d’un millilitre.
Pour commencer, enduire chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits avec deux microgrammes par millilitre d’Anti CD3 Epsilon et quatre microgrammes par millilitre d’Anti CD28 dans 500 microlitres de PBS. Enveloppez l’assiette dans du Parafilm et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir récolté la rate de souris, broyez-la dans un tampon FACS à l’aide de verre dépoli stérilisé pour homogénéiser le tissu en une suspension unicellulaire.
Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Faites tourner la suspension de cellules spléniques à 800 G pendant cinq minutes et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Laissez le mélange reposer à température ambiante pendant cinq minutes.
Ajoutez ensuite le tampon FACS pour atteindre un volume total de 15 millilitres. Après la centrifugation, remettre les splénocytes en suspension dans le tampon FACS et les filtrer à travers une crépine à cellules de 40 micromètres. Ajustez le volume final à un millilitre avec un tampon FACS et isolez les cellules CD4+T à l’aide de kits de réactifs commerciaux, en suivant les instructions du fabricant.
Marquez les cellules CD4+T avec un mélange d’anticorps fluorescents. Après avoir lavé les cellules colorées avec un tampon FACS, isolez les cellules CD4+T naïves à l’aide d’un trieur de cellules à flux. Maintenant, après avoir retiré le surnageant de stimulation lié à la plaque, rincez deux fois chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de PBS.
Plaquez une fois 10 à la puissance de six lymphocytes CD4+ T naïfs dans un millilitre de milieu de culture lymphocytaire dans chaque puits et incubez pendant 18 à 24 heures. Le lendemain, collectez les cellules activées dans des tubes de 1,5 millilitre et centrifugez-les à 800 G pendant cinq minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre du mélange d’infection et ajoutez un millilitre du mélange dans les puits d’une plaque de 48 puits.
Enveloppez la plaque de Parafilm et centrifugez-la à 800 G pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius, avec une accélération et une décélération réglées à trois. Après la centrifugation, retirez le Parafilm et incubez les cellules pendant quatre heures. Pour préparer les cellules présentatrices d’antigènes, ou APC, mettez les splénocytes en suspension dans un millilitre de milieu de culture lymphocytaire contenant 50 microgrammes par millilitre de mitomycine dans un tube de 15 millilitres.
Incuber des splénocytes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez du PBS à la marque des 15 millilitres et centrifugez à 800G pendant cinq minutes. Remettez les splénocytes en suspension dans un millilitre de milieu de culture lymphocytaire et comptez le nombre de cellules sur une machine de comptage de cellules.
Après une infection rétrovirale, centrifuger les lymphocytes T CD4+ transduits dans des tubes de 1,5 millilitre et remettre en suspension les cellules infectées dans 600 microlitres de PBS. Placez 0,5 fois 10 à la puissance six cellules CD4+ T transduites dans un millilitre de milieu de culture lymphocytaire avec 1,5 fois 10 à la puissance six cellules APC dans un puits d’une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Complétez avec deux microgrammes par millilitre d’Anti CD3 Epsilon, deux microgrammes par millilitre d’Anti CD28 et un cocktail de différenciation Th17.
Cultivez les cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après deux jours, centrifugez la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 millilitre et mettez à nouveau la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de culture lymphocytaire contenant trois nanogrammes par millilitre de TGF Beta et 30 nanogrammes par millilitre d’interleukine 6. Transférez les cellules dans les puits d’une plaque de 24 puits pendant deux jours.
Traitez les cellules différenciées avec 50 nanogrammes par millilitre de PMA, 500 nanogrammes par millilitre d’ionomycine et cinq microgrammes par millilitre de brefelden A dans 500 microlitres de milieu de culture lymphocytaire dans un nouveau puits d’une plaque de 24 puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Rassemblez les cellules traitées dans des tubes de 1,5 millilitre contenant un millilitre de tampon FACS.
Après la centrifugation, colorez les cellules avec du PBS contenant un mélange d’anticorps fluorescents à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Lavez les cellules colorées avec 300 microlitres de PBS avant de les fixer avec 300 microlitres de formaldéhyde tamponné à 2 % de phosphate à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. Après avoir lavé les cellules avec du PBS, mettez-les en suspension dans 600 microlitres de tampon de perméabilisation et centrifugez-les à 800G pendant cinq minutes.
Colorez les cellules avec l’anticorps anti-interleukine 17A dans 100 microlitres de tampon de perméabilisation pendant 60 minutes à température ambiante. L’efficacité de l’infection rétrovirale, telle qu’indiquée par les cellules mCherry positives, était d’environ 40 % L’efficacité de la différenciation Th17 était significativement réduite dans les cellules traitées avec un ARN guide unique ciblant le gène ROR Gamma T. Les niveaux d’expression de RORC et d’interleukine 17A ont été considérablement diminués dans les cellules traitées avec un ARN guide unique RORC.
