이 연구는 면역 반응에 중요한 역할을 하는 T 보조 세포의 하위 집합인 Th17 세포의 분화를 연구하기 위한 표준 프로토콜을 제공합니다. Cas9 형질전환 마우스의 1차 T 세포로 가이드 RNA의 레트로바이러스 형질전환을 통해 과학자들은 Th17 분화를 조절하는 유전자의 특정 기능을 연구할 수 있습니다. 이 연구는 정확한 유전자 편집을 위해 CRISPR-Cas9 기술을 사용하고 레트로바이러스 전달을 활용하여 일차 T 세포의 특정 유전자를 효율적으로 표적으로 삼습니다.
유세포 분석은 transduction efficiency를 평가하고 세포 분화를 모니터링하는 데 사용됩니다. CT4+T 세포의 분화를 자극하기 위해 시험관 내 Th17 편광이 수행됩니다. 우리의 연구는 특정 유전자가 Th17 분화를 어떻게 조절하는지에 대한 이해의 격차를 메우는 것을 목표로 합니다.
당사는 CRISPR-Cas9을 레트로바이러스 형질도입과 함께 사용하고 있으며, 이는 기존의 녹아웃 마우스 모델보다 더 빠르고 비용 효율적인 대안을 제공합니다. 당사의 프로토콜은 CD4 T 세포의 레트로바이러스 transduction에 대해 자세히 설명할 뿐만 아니라 다른 프로토콜에서 간과되는 sgRNA 염기서열 훈련 및 플라스미드 구성에 대한 포괄적인 가이드를 제공합니다. 이 백서는 다른 연구자들이 방법론을 쉽게 복제할 수 있도록 실험 과정의 각 단계를 간략하게 설명합니다.
먼저 CRISPick 도구를 사용하여 ROR Gamma T knockout을 위한 단일 가이드 RNA를 설계합니다. 참조 게놈을 Mouse GRCM 38로 설정하고, CRISPRko 가이드 시스템에 따라 PAM 염기서열을 NGG로 지정합니다. Quick Gene Lookup(빠른 유전자 조회) 열 아래의 검색 상자에 타겟 유전자 이름을 입력합니다.
정확한 선택을 위해 시스템에 올바른 유전자 ID와 타겟 유전자의 전체 이름이 표시되는지 확인합니다. 높은 결합 순위 및 선택 순서에 따라 RORC 염기서열에서 표적화된 하나의 단일 가이드 RNA를 선택하여 off-target match를 최소화하고 on-target 효능을 높일 수 있습니다. Mouse Gecko V2 라이브러리에서 비표적 단일 가이드 RNA 염기서열을 선택합니다.
단일 가이드 RNA 및 벡터 염기서열 영역을 위해 설계된 프라이머가 있는 PCR에서 DNA 중합효소를 사용하여 단일 가이드 RORC 및 단일 가이드 비표적 코딩 염기서열을 증폭합니다. 증폭된 염기서열을 PMXU 6MCS 벡터로 클로닝하여 mCherry 형광 단백질이 있는 프레임의 U6 promoter와 guide RNA scaffold 사이에 배치합니다. 그런 다음 벡터 생성을 위한 PCR 프로그램을 설정합니다.
형질주입 하루 전, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM이 함유된 10cm 접시에 6개의 Plat-E 세포의 힘으로 약 8배를 파종합니다. 세포가 80% 포화도에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 아래에서 세포를 배양합니다. 형질주입 1시간 전에 세포 배양 배지를 5% FBS를 함유하지만 페니실린 또는 스트렙토마이신은 포함하지 않는 페놀이 빨간색이 없는 8ml의 따뜻한 환원 혈청 배지로 교체합니다.
형질주입 Mix 1 및 Mix 2를 준비합니다. 한 방울씩 Mix 2를 Mix 1에 넣고 부드럽게 섞습니다. 혼합물을 섭씨 20-25도에서 15-20분 동안 배양합니다.
플레이트를 부드럽게 소용돌이치면서 형질주입 혼합물을 Plat-E 세포에 한 방울씩 떨어뜨립니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 함유한 세포를 6-12시간 동안 배양합니다. 배양 후 배지를 10ml의 신선한 세포 배양 배지로 교체하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 48시간 동안 계속 배양합니다.
형광 현미경을 사용하여 레트로바이러스 벡터 태그를 검출하여 Plat-E 세포의 transfection 효율을 평가합니다. 다음으로, 바이러스 함유 배양 상등액을 1, 500G에서 10분간 원심분리하여 세포 단편을 제거합니다. 바이러스가 함유된 상등액을 1ml 바이알에 분취합니다.
먼저 24웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 PBS에 Anti CD3 Epsilon이 밀리리터당 2마이크로그램, Anti CD28이 밀리리터당 4마이크로그램으로 코팅합니다. 접시를 파라필름으로 싸서 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 배양합니다. 쥐의 비장을 채취한 후, 멸균된 분쇄 유리를 사용하여 FACS 완충액으로 분쇄하여 조직을 단일 세포 현탁액으로 균질화합니다.
70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 50ml 튜브로 여과합니다. 800G에서 5분 동안 비장 세포 현탁액을 회전시키고 펠릿을 2ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.
그런 다음 FACS 버퍼를 추가하여 총 부피가 15밀리리터에 도달하도록 합니다. 원심분리 후 FACS 완충액에 비장세포를 재현탁하고 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과합니다. FACS 버퍼를 사용하여 최종 부피를 1ml로 조정하고 제조업체의 지침에 따라 상용 시약 키트를 사용하여 CD4+T 셀을 분리합니다.
CD4+T 세포에 형광 항체 혼합물을 표시합니다. 염색된 세포를 FACS 완충액으로 세척한 후 플로우 셀 분류기를 사용하여 naive CD4+T 세포를 분리합니다. 이제 플레이트에 결합된 자극 상층액을 제거한 후 24웰 플레이트의 각 웰을 500마이크로리터의 PBS로 두 번 헹굽니다.
각 웰에 있는 1밀리리터의 림프구 배양 배지에 6개의 순수 CD4+T 세포의 힘으로 10을 곱한 플레이트를 만들고 18-24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 활성화된 세포를 1.5ml 튜브에 모으고 800G에서 5분 동안 원심분리합니다. 감염 혼합물 1ml에 세포 펠릿을 재현탁시키고 혼합물 1ml를 48웰 플레이트의 웰에 추가합니다.
파라필름으로 플레이트를 감싸고 800G에서 섭씨 32도에서 90분 동안 원심분리하고 가속과 감속을 3으로 설정합니다. 원심분리 후 파라필름을 제거하고 4시간 동안 세포를 배양합니다. 항원 제시 세포(APC)를 준비하려면 15ml 튜브에 미토마이신(mitomycin)당 50마이크로그램을 함유한 1ml의 림프구 배양 배지에 비장세포를 재현탁합니다.
섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 비장세포를 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 15ml 표시에 추가하고 800G에서 5분 동안 원심분리합니다. 1ml의 림프구 배양 배지에 비장 세포를 재현탁시키고 세포 계수기에서 세포 수를 계산합니다.
레트로바이러스 감염 후, 1.5 밀리리터 튜브에서 형질도입된 CD4+T 세포를 원심분리하고, 600 마이크로리터의 PBS에 감염된 세포를 재현탁시킵니다. 1ml의 림프구 배양 배지에 6개의 형질도입된 CD4+T 세포의 거듭제곱에 0.5의 10을 24웰 세포 배양 플레이트의 웰에 1.5의 10배로 6개의 APC 세포의 거듭제곱으로 놓습니다. Anti CD3 Epsilon의 밀리리터당 2마이크로그램, Anti CD28의 밀리리터당 2마이크로그램 및 Th17 분화 칵테일을 보충하십시오.
세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 2일 동안 배양합니다. 2일 후, 1.5 millil 튜브에서 세포 현탁액을 원심분리하고 TGF Beta 1 밀리리터당 3 나노그램 및 인터루킨 6 밀리리터당 30 나노그램을 함유한 1 밀리리터의 림프구 배양 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포를 24웰 플레이트의 웰로 이틀 동안 옮깁니다.
24웰 플레이트의 새로운 웰에서 500마이크로리터의 림프구 배양 배지에 PMA 밀리리터당 50나노그램, 이오노마이신 밀리리터당 500나노그램, 브레펠덴 A 밀리리터당 5마이크로그램으로 분화된 세포를 처리합니다. 세포를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 처리된 세포를 1ml의 FACS 완충액이 들어 있는 1.5ml 튜브에 수집합니다.
원심분리 후 형광 항체 혼합물이 포함된 PBS로 세포를 섭씨 4도에서 30분 동안 염색합니다. 염색된 세포를 300마이크로리터의 PBS로 세척한 후 섭씨 4도에서 60분 동안 300마이크로리터의 2% 인산염 완충 포름알데히드로 고정합니다. PBS로 세포를 세척한 후 600마이크로리터의 투과화 완충액에 재현탁시키고 800G에서 5분 동안 원심분리합니다.
항-인터루킨 17A 항체로 100마이크로리터의 투과화 완충액에 세포를 실온에서 60분 동안 염색합니다. mCherry 양성 세포에 의해 나타난 바와 같이 레트로바이러스 감염 효율은 ROR Gamma T 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA로 처리된 세포에서 약 40%의 Th17 분화 효율이 현저히 감소했습니다. RORC 및 인터루킨 17A의 발현 수준은 단일 가이드 RNA RORC로 처리된 세포에서 상당히 감소했습니다.
