Bu çalışma, immün yanıtlarda önemli bir rol oynayan T yardımcı hücrelerinin bir alt kümesi olan Th17 hücrelerinin farklılaşmasını incelemek için standart bir protokol sunmaktadır. Kılavuz RNA'nın Cas9 transgenik farelerden birincil T hücrelerine retroviral transdüksiyonu yoluyla, bilim adamları Th17 farklılaşmasını düzenlemede genlerin özel işlevini inceleyebilirler. Bu çalışma, hassas gen düzenleme için CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanır ve birincil T hücrelerindeki spesifik genleri verimli bir şekilde hedeflemek için retroviral transdüksiyon kullanır.
Akış sitometrisi, transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek ve hücre farklılaşmasını izlemek için kullanılır. CT4 + T hücrelerinin farklılaşmasını uyarmak için in vitro Th17 polarizasyonları gerçekleştirilir. Araştırmamız, spesifik genlerin Th17 farklılaşmasını nasıl düzenlediğinin anlaşılmasındaki boşlukları doldurmayı amaçlamaktadır.
Geleneksel nakavt fare modellerine daha hızlı ve daha uygun maliyetli bir alternatif sunan retroviral transdüksiyon ile birlikte CRISPR-Cas9 kullanıyoruz. Protokolümüz sadece CD4 T hücrelerinin retroviral transdüksiyonunu detaylandırmakla kalmaz, aynı zamanda diğer protokollerde göz ardı edilen eğitim sgRNA dizileri ve plazmitlerin inşası hakkında kapsamlı bir rehber sağlar. Bu makale, deneysel sürecin her adımını ana hatlarıyla belirterek, diğer araştırmacıların metodolojiyi kolayca kopyalayabilmelerini sağlar.
Başlamak için, ROR Gamma T nakavtı için tek kılavuz RNA'yı tasarlamak için CRISPick aracını kullanın. Referans genomunu Fare GRCM 38 olarak ayarlayın ve CRISPRko kılavuz sistemine dayalı olarak PAM dizisini NGG olarak belirtin. Hızlı Gen Arama sütununun altındaki arama kutusuna hedef gen adını girin.
Doğru seçimi sağlamak için sistemin doğru gen kimliğini ve hedef genin tam adını gösterdiğini doğrulayın. Hedef dışı eşleşmeleri en aza indirmek ve hedef üzerindeki etkinliği artırmak için yüksek birleşik sıralama ve seçim sırasına dayalı olarak RORC dizisinde hedeflenen tek bir kılavuz RNA seçin. Mouse Gecko V2 kitaplıklarından hedeflemeyen tek kılavuz RNA dizisini seçin.
Tek kılavuzlu RNA ve vektör dizi bölgeleri için tasarlanmış primerlere sahip bir PCR'de DNA polimeraz kullanarak tek kılavuzlu RORC ve tek kılavuzlu hedef olmayan kodlama dizilerini çoğaltın. Amplifiye edilmiş dizileri PMXU 6MCS vektörüne klonlayın ve bunları mCherry floresan proteini ile çerçeve içinde U6 promotörü ile kılavuz RNA iskelesi arasına yerleştirin. Ardından vektör yapımı için bir PCR programı kurun.
Transfeksiyondan bir gün önce,% 10 FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş DMEM içeren 10 santimetrelik bir tabakta altı Plat-E hücresinin gücüne yaklaşık sekiz kez 10 kez tohumlayın. Hücreleri% 80 birleşme noktasına ulaşana kadar% 5 karbondioksit altında% 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfeksiyondan bir saat önce, hücre kültürü ortamını,% 5 FBS içeren, ancak penisilin veya streptomisin içermeyen, fenol kırmızısı içermeyen sekiz mililitre ılık indirgenmiş serum ortamı ile değiştirin.
Transfeksiyonu hazırlayın Karışım 1 ve Karışım 2. Damla damla, Karışım 2'yi Karışım 1'e ekleyin ve hafifçe karıştırın. Karışımı 20 ila 25 santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin.
Plakayı hafifçe döndürürken, transfeksiyon karışımını damla damla Plat-E hücrelerine ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile altı ila on iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı 10 mililitre taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin.
Floresan mikroskobu kullanarak retroviral vektör etiketini tespit ederek Plat-E hücrelerinde transfeksiyon verimliliğini değerlendirin. Daha sonra, hücre parçalarını çıkarmak için virüs içeren kültür süpernatanı 1.500G'de 10 dakika santrifüjleyin. Virüs içeren süpernatanı bir mililitrelik şişelere koyun.
Başlamak için, 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğunu, 500 mikrolitre PBS'de mililitre başına iki mikrogram Anti CD3 Epsilon ve mililitre başına dört mikrogram Anti CD28 ile kaplayın. Plakayı Parafilm'e sarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Fare dalağını topladıktan sonra, dokuyu tek hücreli bir süspansiyon halinde homojenize etmek için sterilize edilmiş buzlu cam kullanarak FACS tamponunda öğütün.
Hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Dalak hücresi süspansiyonunu 800G'de beş dakika döndürün ve peleti iki mililitre kırmızı hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika bekletin.
Ardından toplam 15 mililitre hacme ulaşmak için FACS tamponu ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, splenositleri FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. FACS tamponu ile son hacmi bir mililitreye ayarlayın ve üreticinin talimatlarını izleyerek ticari reaktif kitlerini kullanarak CD4+T hücrelerini izole edin.
CD4 + T hücrelerini floresan antikor karışımı ile etiketleyin. Lekeli hücreleri FACS tamponu ile yıkadıktan sonra, saf CD4 + T hücrelerini bir akış hücresi sıralayıcı kullanarak izole edin. Şimdi, plakaya bağlı stimülasyon süpernatantını çıkardıktan sonra, 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 500 mikrolitre PBS ile iki kez durulayın.
Her bir oyukta bir mililitre lenfosit kültürü ortamında altı saf CD4 + T hücresinin gücüne 10 kez plaka koyun ve 18 ila 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, aktive edilmiş hücreleri 1.5 mililitrelik tüplere toplayın ve beş dakika boyunca 800G'de santrifüjleyin. Hücre peletini enfeksiyon karışımının bir mililitresinde yeniden süspanse edin ve karışımın bir mililitresini 48 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin.
Plakayı Parafilm ile sarın ve 800G'de 32 santigrat derecede 90 dakika boyunca santrifüjleyin, hızlanma ve yavaşlama üçe ayarlandı. Santrifüjlemeden sonra Parafilmi çıkarın ve hücreleri dört saat inkübe edin. Antijen sunan hücreleri veya APC'yi hazırlamak için, 15 mililitrelik bir tüpte mililitre başına 50 mikrogram mitomisin içeren bir mililitre lenfosit kültürü ortamında splenositleri yeniden süspanse edin.
Splenositleri bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, PBS'yi 15 mililitre işaretine ekleyin ve beş dakika boyunca 800G'de santrifüjleyin. Splenositleri bir mililitre lenfosit kültür ortamında yeniden süspanse edin ve bir hücre sayaç makinesinde hücre sayısını sayın.
Retroviral enfeksiyondan sonra, transdüksiyona uğramış CD4 + T hücrelerini 1.5 mililitrelik tüplerde santrifüjleyin ve enfekte olmuş hücreleri 600 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir mililitre lenfosit kültürü ortamında 0.5 çarpı 10 üzeri altı dönüştürülmüş CD4 + T hücresinin kuvveti ile 1.5 çarpı 10 üzeri altı APC hücresinin kuvveti ile 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının kuyucuğuna yerleştirin. Mililitre başına iki mikrogram Anti CD3 Epsilon, mililitre başına iki mikrogram Anti CD28 ve bir Th17 farklılaşma kokteyli ile takviye edin.
Hücreleri iki gün boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kültürleyin. İki gün sonra, hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik tüplerde santrifüjleyin ve peleti, mililitre başına üç nanogram TGF Beta ve mililitre başına 30 nanogram interlökin 6 içeren bir mililitre lenfosit kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri iki gün boyunca 24 oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın.
Farklılaşmış hücreleri, 24 oyuklu bir plakanın yeni bir kuyucuğunda 500 mikrolitre lenfosit kültür ortamında mililitre PMA başına 50 nanogram, mililitre iyonomisin başına 500 nanogram ve mililitre brefelden A başına beş mikrogram ile tedavi edin. Hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İşlem görmüş hücreleri, bir mililitre FACS tamponu içeren 1.5 mililitrelik tüplere toplayın.
Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecede bir floresan antikor karışımı içeren PBS ile boyayın. Lekeli hücreleri 300 mikrolitre PBS ile yıkayın ve 300 mikrolitre% 2 fosfat tamponlu formaldehit ile 60 dakika boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, 600 mikrolitre geçirgenlik tamponunda tekrar süspanse edin ve beş dakika boyunca 800G'de santrifüjleyin.
Hücreleri 100 mikrolitre geçirgenlik tamponunda anti-interlökin 17A antikoru ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca boyayın. mCherry pozitif hücreler tarafından belirtildiği gibi retroviral enfeksiyon etkinliği yaklaşık% 40 idi. ROR Gamma T genini hedefleyen tek kılavuz RNA ile tedavi edilen hücrelerde Th17 farklılaşma verimliliği önemli ölçüde azaldı. RORC ve interlökin 17A'nın ekspresyon seviyeleri, tek kılavuz RNA RARC ile tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde azalmıştır.
