我们提出了一种方案，通过将诱导多能干细胞衍生的造血祖细胞掺入神经元类器官诱导和发育过程中，生成包含常驻小胶质细胞和神经元的人脑类器官。该方法提供了一个模型来研究人脑发育过程中小胶质细胞和神经元之间的相互作用。3D 脑类器官是由诱导多能干细胞或 iPSC 产生的微型大脑。
作为动物和人类受试者的替代品，它们已被广泛用于模拟大脑发育和神经系统疾病的研究。它们是推进人类健康研究的绝佳工具。3D 人脑类器官的常规方案很少产生小胶质细胞，即人脑的常驻免疫细胞，因为这些细胞来自与神经元不同的胚胎谱系。
虽然小胶质细胞可以在分化的后期添加到大脑类器官中，但需要一种更好地模拟人脑发育的方法。大多数其他方案在脑类器官生成结束时添加 HPC 或小胶质细胞。在神经诱导之前，我们从混合的 iPSC 和 HPC 中生成胚状体。
这可能更好地模拟人脑发育，因为小胶质细胞前体在发育的早期就迁移到大脑。此外，使用 HPC 可以节省总分化时间，因为小胶质细胞分化方案通常需要 30 天以上。因此，我们的方案可以节省时间和试剂成本。
首先，在含有 1 毫升 E8 Flex 培养基的 12 孔板中培养解离的人诱导多能干细胞或 iPSC，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞 24 小时。第二天，在显微镜下检查菌落，并通过扫描孔中的所有字段来计算菌落的数量。用造血试剂盒中的 1 毫升培养基 A 替换培养基。
将板放回培养箱中 48 小时。第 3 天，用 500 微升新鲜培养基 A 替换 500 微升用过的培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。第二天，观察细胞生长和从 iPSC 集落分化。
用 1 毫升培养基 B 替换培养基，在显微镜下监测细胞分化，并每隔一天用 500 微升培养基 B 更换一半培养基，持续 6 至 7 天。第 10 天，观察明亮的单圆形细胞的存在，其形态为正常造血祖细胞或 HPC，漂浮或松散地附着在带有一些松散聚集体的扁平层细胞上。接下来，通过使用 1 毫升移液器吸头上下吹液 3 次来收集所有不同的 HPC。
将细胞转移到 15 毫升试管中。将细胞悬液以 300G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 mL 培养基 B 中，将 20 μL 细胞悬液加入细胞计数室中，并使用细胞仪对细胞进行计数。使用培养基 B 将细胞浓度调整为 100 万个细胞/毫升.连续稀释培养技术产生适当数量和大小的 iPSC 集落，在培养基 A 中培养结束时，菌落显示出显着的形态变化.在培养基 B 中培养三天后，观察到 HPC 分化，出现均匀的圆形细胞。
在第 10 天，HPC 主要形成集落状簇，没有明显的碎片。收集从人类 iPSC 分化而来的 HPC 后，验证 iPSC 的培养物是否已达到 80% 汇合。将 500 微升抗粘附冲洗液加入微孔板的一个孔中，以最大限度地减少气泡形成。
在装有板架的水平转头中以 2， 000G 离心板 5 分钟。完全去除冲洗液，用 1 毫升 DPBS 洗涤孔，然后用 1 毫升 DMEM/F-12 洗涤孔两次，不产生气泡。用 1 毫升 ACCUTASE 溶液处理 iPSC 以启动细胞解离。
在显微镜下观察细胞，注意到细胞分离的迹象，而细胞仍然附着在底部。用 1 毫升 DMEM/F-12 培养基替换 ACCUTASE 溶液，然后上下混合，将细胞解离成单个细胞。将解离的细胞转移到 15 mL 试管中，并加入 DMEM/F-12 培养基，使最终体积达到 5 mL。
将细胞以 300G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 mL E8 Flex 培养基中。对细胞进行计数，以将 E8 Flex 培养基中的细胞浓度调整为 100 万个细胞/毫升。接下来，将 iPSC 与 HPC 以 2：1 的比例混合到微孔培养板的孔中。
将每 1 毫升培养基中加入 1 微升 ROCK 抑制剂 Y-27632 储备溶液到上清液中，并左右摇动板。将板以 300G 离心 5 分钟，并在显微镜下观察以确认细胞已沉淀到微孔中。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育。
48 小时后，在显微镜下观察细胞是否有拟胚体 （EB） 形成。接下来，用 500 μL 抗粘附冲洗缓冲液处理 24 孔细胞培养板 15 分钟，以形成低贴壁板。用 1 毫升 DPBS 洗涤孔两次，并向每个孔中加入 1 毫升 E8 Flex 培养基。
使用 1 毫升宽孔移液器吸头，将 EB 重悬于微孔培养板中。然后，对于低吸附 24 孔板的每个孔，加入 100 微升含有 EB 的培养基。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中孵育 48 小时。
首先，将基底膜基质的等分试样在冰上解冻 30 分钟。在 EB 形成后的第二天，使用预冷的 20 微升移液器吸头，在培养基顶部以小滴加入 15 微升冰冷的基底膜基质以包被 EB。将板置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中 48 小时。
在 EB 形成后的第 4 天，小心去除 500 微升培养基，而不干扰 EB 并重复基底膜基质涂层，如前所述。然后，在细胞顶部添加 500 μL 多能干细胞神经诱导培养基。将板放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中。
在第 6 天和第 8 天，小心地用 500 微升新鲜神经诱导培养基替换 500 微升培养基，进行半培养基更换。在第 10 天、第 12 天和第 14 天孵育后，用神经干细胞培养基进行半培养基更换。第 15 天，将含孔球体与培养基一起转移到用 Anti-Adinence 冲洗溶液处理的新 12 孔板中。
在培养物顶部添加 500 μL 神经元成熟培养基。在成熟阶段，监测培养基是否有营养消耗的迹象，例如颜色变化。如果观察到营养耗尽，则将类器官转移到六孔板中。
第 17 天，在成熟培养基中补充细胞因子 6 天，以促进小胶质细胞成熟。最后，在第 23 天，收集所得的神经类器官进行表征。高质量的 HPC 和 iPSC 混合物在 24 小时内形成 EB，显示出持续生长和最少的碎片。
转移到新板后，EBS 继续生长，直到在成熟培养基中达到平台期。
