İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı hematopoietik progenik hücreleri nöronal organoid indüksiyon ve gelişim sürecine dahil ederek yerleşik mikroglia ve nöronlar içeren bir insan beyni organoidi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan beyninin gelişimi sırasında mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşimleri incelemek için bir model sağlar. 3D beyin organoidleri, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden veya iPSC'lerden üretilen mini beyinlerdir.
Hayvanlara ve insan deneklere bir alternatif olarak, beyin gelişimi ve nörolojik bozuklukların araştırılmasında insan beynini taklit etmede yaygın olarak kullanılmaktadırlar. İnsan sağlığı araştırmalarını ilerletmek için harika araçlardır. 3D insan beyni organoidleri için geleneksel protokoller nadiren insan beyninin yerleşik bağışıklık hücresi olan mikroglia üretir, çünkü bu hücreler nöronlardan farklı bir embriyonik soydan kaynaklanır.
Mikroglia, farklılaşmanın daha sonraki bir aşamasında beyin organoidlerine eklenebilirken, insan beyninin gelişimini daha iyi taklit etmek için bir yönteme ihtiyaç vardır. Diğer protokollerin çoğu, serebral organoid oluşumunun sonunda HPC'ler veya mikroglia ekler. Nöral indüksiyondan önce karışık iPSC'lerden ve HPC'lerden embriyoid cisimler üretiyoruz.
Bu, insan beyninin gelişimini daha iyi taklit edebilir, çünkü mikroglia öncüleri gelişimin çok erken dönemlerinde beyne göç eder. Ek olarak, HPC'lerin kullanılması, mikroglia farklılaşma protokolleri genellikle 30 günden fazla sürdüğü için toplam farklılaşma süresinden tasarruf sağlar. Bu nedenle, protokolümüz zamandan ve reaktif maliyetlerinden tasarruf sağlayabilir.
Başlamak için, kültür, bir mililitre E8 Flex ortamı içeren 12 oyuklu bir plakada insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri veya iPSC'leri ayrıştırır, hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe eder. Ertesi gün mikroskop altında kolonileri kontrol edin ve bir kuyudaki tüm alanları tarayarak koloni sayılarını sayın. Ortamı hematopoetik kitten bir mililitre Ortam A ile değiştirin.
Plakayı 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun. Üçüncü günde, harcanan ortamın 500 mikrolitresini 500 mikrolitre taze Orta A ile değiştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, hücre büyümesini ve iPSC kolonilerinden farklılaşmayı gözlemleyin.
Mikroskop altında hücre farklılaşmasını izleyin ve altı ila yedi gün boyunca her gün 500 mikrolitre Orta B ile yarım orta değişim gerçekleştirin. 10. günde, normal hematopoietik progenitör hücrelerin veya HPC'lerin morfolojisine sahip, bazı gevşek agregalarla düz tabaka hücresine yüzen veya gevşek bir şekilde bağlanmış parlak tek yuvarlak hücrelerin varlığını gözlemleyin. Ardından, bir mililitrelik pipet ucuyla üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tüm farklı HPC'leri toplayın.
Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 300G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti bir mililitre Orta B'de yeniden süspanse edin.20 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir hücre sayma odasına ekleyin ve bir hücre ölçer kullanarak hücreleri sayın. Seri seyreltme kültürü tekniği, Orta A'da kültürün sonunda önemli morfolojik değişiklikler gösteren kolonilerle uygun sayıda ve boyutta iPSC kolonisi üretti.Orta B'de üç gün sonra, homojen yuvarlak hücrelerin ortaya çıkmasıyla HPC farklılaşması gözlendi.
10. günde, HPC'ler ağırlıklı olarak önemli döküntüler olmadan koloni benzeri kümeler oluşturdu. İnsan iPSC'lerinden farklı HPC'leri topladıktan sonra, bir iPSC'nin kültürünün %80 birleşmeye ulaştığını doğrulayın. Mikro kuyucuk plakasının bir kuyucuğuna 500 mikrolitre Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu ekleyerek kabarcık oluşumunu en aza indirin.
Plakayı, plaka tutucularla donatılmış sallanan bir kova rotorunda beş dakika boyunca 2.000G'de döndürün. Durulama solüsyonunu tamamen çıkarın ve kuyucukları iki kez bir mililitre DPBS ile ve ardından kabarcık oluşturmadan bir mililitre DMEM / F-12 ile yıkayın. Hücre ayrışmasını başlatmak için iPSC'leri bir mililitre ACCUTASE solüsyonu ile tedavi edin.
Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin, hücreler dibe bağlı kalırken hücre ayrılma belirtilerini not edin. ACCUTASE çözeltisini bir mililitre DMEM / F-12 ortamı ile değiştirin, ardından hücreleri tek hücrelere ayırmak için yukarı ve aşağı karıştırın. Ayrışmış hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş mililitrelik bir nihai hacme ulaşmak için DMEM / F-12 ortamı ekleyin.
Hücreleri 300G'de beş dakika santrifüjleyin ve peleti bir mililitre E8 Flex ortamında yeniden süspanse edin. E8 Flex ortamında hücre konsantrasyonunu mililitrede 1 milyon hücreye ayarlamak için hücreleri sayın. Daha sonra, iPSC'leri HPC'lerle ikiye bir oranında mikro kuyu kültür plakasının kuyusuna karıştırın.
Süpernatana bir mililitre ortam başına bir mikrolitre ROCK İnhibitörü Y-27632 stok çözeltisi ekleyin ve plakayı yan yana sallayın. Plakayı beş dakika boyunca 300G'de döndürün ve hücrelerin mikro kuyucuklara yerleştiğini doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.
48 saat sonra, embriyoid cisimcikleri veya EB'lerin oluşumu için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Daha sonra, düşük bir bağlantı plakası oluşturmak için 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasını 500 mikrolitre Yapışma Önleyici Durulama Tamponu ile 15 dakika boyunca tedavi edin. Kuyucukları bir mililitre DPBS ile iki kez yıkayın ve her oyuğa bir mililitre E8 Flex ortamı ekleyin.
Bir mililitre genişliğinde delikli bir pipet ucu kullanarak, EB'leri mikro kuyu kültür plakasında yeniden süspanse edin. Ardından, düşük bağlantılı 24 oyuklu plakanın her bir oyuğu için, EB'leri içeren 100 mikrolitre ortam ekleyin. Plakayı 37 derece ve% 5 karbondioksit inkübatörde 48 saat inkübe edin.
Başlamak için, bazal membran matrisinin alikotlarını 30 dakika boyunca buz üzerinde çözün. EB oluşumundan sonraki ikinci günde, önceden soğutulmuş 20 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, EB'leri kaplamak için ortamın üzerine küçük damlalar halinde 15 mikrolitre buz gibi soğuk bazal membran matrisi ekleyin. Plakayı 48 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatöre yerleştirin.
EB oluşumundan sonraki dördüncü günde, EB'leri bozmadan 500 mikrolitre ortamı dikkatlice çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi bazal membran matris kaplamasını tekrarlayın. Ardından, hücrelerin üzerine 500 mikrolitre pluripotent kök hücre nöral indüksiyon ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit hücre inkübatörüne yerleştirin.
Altıncı ve sekizinci günlerde, 500 mikrolitre ortamı 500 mikrolitre taze nöral indüksiyon ortamıyla dikkatlice değiştirerek yarı-orta bir değişiklik yapın. 10, 12 ve 14. günlerde inkübasyondan sonra, nöral kök hücre ortamı ile yarı-orta bir değişiklik yapın. 15. günde, iyi içeren küreleri, ortamla birlikte, Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu ile muamele edilmiş 12 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.
Kültürün üzerine 500 mikrolitre nöronal olgunlaşma ortamı ekleyin. Olgunlaşma aşamasında, ortamı renk değişikliği gibi besin tükenmesi belirtileri açısından izleyin. Besin tükenmesi gözlenirse, organoidi altı oyuklu bir plakaya aktarın.
17. günde, mikroglial olgunlaşmayı kolaylaştırmak için olgunlaşma ortamını altı gün boyunca sitokinlerle destekleyin. Son olarak, 23. günde, karakterizasyon için elde edilen nöral organoidleri toplayın. Yüksek kaliteli HPC ve iPSC karışımları, 24 saat içinde EB'ler oluşturarak sürekli büyüme ve minimum kalıntı gösterdi.
Yeni bir plakaya aktarıldıktan sonra, EBS olgunlaşma ortamında bir platoya ulaşana kadar büyümeye devam etti.
