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Dieses Video Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur Erlangung der Gibbs-Membran Proteinfaltung durch Tryptophan-Fluoreszenz.
Membrane Proteinfaltung ist ein aufstrebendes Thema sowohl mit Grundlagen-und gesundheitsbezogene Bedeutung. Die Fülle von Membranproteinen in der Zelle zugrunde liegt die Notwendigkeit einer umfassenden Studie über die Faltung von dieser allgegenwärtigen Familie von Proteinen. Darüber hinaus haben Fortschritte in unserer Fähigkeit, Krankheiten, die mit falsch gefalteten Proteinen assoziiert kennzeichnen signifikante experimentelle und theoretische Anstrengungen auf dem Gebiet der Proteinfaltung motiviert. Schnelle Fortschritte in diesem wichtigen Bereich ist leider durch die inhärenten Herausforderungen mit Membranproteinen und der Komplexität der Klappmechanismus verbunden behindert. Hier skizzieren wir ein experimentelles Verfahren zur Messung der thermodynamischen Eigenschaft der Gibbs-Energie der Entfaltung in Abwesenheit von Denaturierungsmittel, Δ G ° H 2 O, für eine repräsentative integrales Membranprotein von E. coli. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Anwendung der Fluoreszenz-Spektroskopie, um das Gleichgewicht Populationen von gefalteten und ungefalteten Zuständen als Funktion der Denaturierungsmittel Konzentration zu bestimmen. Experimentelle Überlegungen für die Herstellung von synthetischen Lipidvesikeln sowie wichtige Schritte in der Datenanalyse Verfahren sind hervorgehoben. Diese Technik ist vielseitig und kann mit verschiedenen Arten von Denaturierungsmittel, einschließlich Temperatur und pH-Wert, sowie in verschiedenen Umgebungen Faltung von Lipiden und Mizellen verfolgt werden. Das aktuelle Protokoll ist eine, die verallgemeinert werden, um eine Membran oder lösliches Protein, das die Kriterien erfüllt, kann unten besprochen.
1. Vorbereitung von ~ 50 nm Durchmesser kleine unilamellare Vesikel (SUVs) für Membrane Protein Folding
2. Probenvorbereitung für die anfängliche Fluoreszenz Unfolding Curve
3. Die Messung der Fluoreszenz-Spektren
Tryptophan-Fluoreszenz jeder Probe und Blank wird mit einem steady-state-Fluorometer. Fluoreszenzspektren sollte mit Anregungswellenlänge von 290 nm aufgezeichnet werden, um Anregung von Tyrosinresten zu vermeiden, und gescannte 305 bis 500 nm liegt. Typische Ein-und Ausgang Bandpass ist 3 nm. Die Wellenlänge Inkrement-und Integrationszeit für Signal-Rausch-Verhältnis optimiert werden. Typische Werte für Wellenlängen Inkrement-und Integrationszeit sind 1 nm / Schritt und 0,5 sec / Schritt jeweils. Membranproteine in der Regel falten sich in synthetischen Lipiden nur dann, wenn die Temperatur über die Doppelschicht Phasenübergangstemperatur ist. Daher wird in diesem Fall von DMPC, ist die Temperatur der Probe konstant gehalten ° bei 30 C. Ein Mikrovolumens Quarzglas-Küvette mit 160 ul beträgt in diesen ex genutztExperimente.
4. Generierung von Initial Unfolding Curve und Abschätzung der Gibbs-Membrane Protein Unfolding
5. Optimierte Unfolding Curve für genauere Messung der Gibbs-Energie der Entfaltung.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Probe | endg. [Urea], M | Lager-Protein (ul) | Lager Lipid (ul) | Sofort lieferbar 10 M Harnstoff (ul) | Lager-Puffer (ul) |
1 | ~ 0,16 | 4 | 40 | 0 | 156 |
2 | 1 | 4 | 40 | 20 | 136 |
3 | 2 | 4 | 40 | 40 | 116 |
4 | 3 | 4 | 40 | 60 | 96 |
5 | 4 | 4 | 40 | 80 | 76 |
6 | 5 | 4 | 40 | 100 | 56 |
7 | 6 | 4 | 40 | 120 | 36 |
8 | 7 | 4 | 40 | 140 | 16 |
Tabelle 1. Volume von Stammlösungen benötigt, um Fluoreszenz-Proben machen
Abbildung 1. Tryptophan-Fluoreszenz-Spektren von ~ 5 uM Vertreter Membranprotein, dass eine einzige Tryptophanrest enthält. (A) Raw Fluoreszenzspektren von Protein (Spektrum A von 4,2), (B) Raw Fluoreszenzspektren blank (Spektrum B von 4,2), (C) Berichtigt Spektrum von 4,2.
Abbildung 2. Korrigierte Tryptophan Fluoreszenzspektren von Membranproteinen aus Abbildung 1 für eine Vielzahl von Harnstoff-Konzentrationen.
Abbildung 3. Unfolding Kurve aus den Daten in Abbildung 2 erhalten, mit fit Gleichung in 4.4. Die Gibbs-Energie ist nach Abschnitt 4.5 berechnet.
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Generation der Entfaltung Kurven von Membran-assoziierte Proteine und Peptide, die Tryptophan enthalten. Hier wird davon ausgegangen, dass die Tryptophan-Fluoreszenz spiegelt, ob das Protein gefaltet ist und eingefügt in synthetische Lipidvesikel oder entfaltet in Lösung. Zusätzliche Annahmen, wie zB Zwei-Staaten-Faltung und lineare Abhängigkeit der freien Energie mit Denaturierungsmittel Konzentration, sind in dem aktuellen Bericht gemacht;. Modifikation von diesen Annahm...
Wir danken Peking Wu für die Verwendung ihrer Daten. Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award an JEK unterstützt
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | ||
Urea | MP Biochemicals | 04821527 | ||
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher | P288 | ||
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher | P285 |
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