Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Method Article
Models of Tumorzellinvasion in dreidimensionale extrazelluläre Matrix besser widerspiegeln In vivo Situation als zweidimensionale Beweglichkeit Assays. Mit Matrix-Invasion Assays mit konfokale Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zellen, detaillierte Informationen über die Invasion Modi und die einzelnen Beiträge zu den führenden im Vergleich zu folgenden Zellen kombiniert erreicht werden kann.
Ein charakteristisches Merkmal von Krebs Malignität Invasion und Metastasierung 1. In einigen Krebsarten (e. g. Gliom 2), lokale Invasion in das umgebende gesunde Gewebe ist die Ursache von Krankheit und Tod. Für andere Krebsarten (e. g. Brust, Lunge, etc.), Wird der Prozess der Metastasierung ist, in die Tumorzellen von einem Primärtumor Masse zu bewegen, zu kolonisieren distalen Seiten und letztendlich zum Organversagen beitragen, dass führt schließlich zu Morbidität und Sterblichkeit 3. Es wurde geschätzt, dass der Invasion und Metastasierung verantwortlich für 90% der Krebstodesfälle 4 sind. Als Ergebnis gab es reges Interesse bei der Identifizierung der molekularen Prozesse und kritische Protein Mediatoren der Invasion und Metastasierung für die Zwecke der Verbesserung von Diagnose und Behandlung 5 gewesen.
Eine Herausforderung für Krebsforscher ist Invasionsassays hinreichend ähneln den in-vivo-Situation zu entwickelngenaue Krankheit Modellierung 6 zu ermöglichen. Zweidimensionale Zellmotilität Assays sind nur informativ über einen Aspekt der Invasion und berücksichtigen nicht die extrazelluläre Matrix (ECM)-Protein Umbau, die auch ein kritisches Element zu nehmen. In jüngster Zeit hat die Forschung unser Verständnis von Tumorzellinvasion verfeinert und gezeigt, dass einzelne Zellen kann durch längliche oder runde Modi 7 zu bewegen. Darüber hinaus hat es eine größere Wertschätzung des Beitrags der kollektiven Invasion in die Zellen eindringen in Stränge, Platten und Clustern, insbesondere in hoch differenzierten Tumoren, die epithelialen Eigenschaften beizubehalten, um die Ausbreitung von Krebs 8 wurden.
Wir präsentieren eine raffinierte Methode 9 für die Prüfung der Beiträge der Kandidaten-Proteine, um kollektive Invasion 10. Insbesondere durch technische separate Pools von Zellen auf verschiedene fluoreszierende Proteine exprimieren, ist es möglich, molekular sezieren die Aktivitäten und Proteins in führenden Zellen im Vergleich zu denen in folgenden Zellen erforderlich erforderlich. Die Verwendung von RNAi stellt die molekulare Werkzeug, um experimentell zu zerlegen die Prozesse in einzelne Zelle Invasion sowie in verschiedenen Positionen der kollektiven Invasion beteiligt. In diesem Verfahren, Mischungen von fluoreszenzmarkierten Zellen auf dem Boden eines Transwell einfügen zuvor mit Matrigel ECM-Protein gefüllt sind vernickelt, dann erlaubt, "nach oben" durch den Filter und in den Matrigel Invasion. Rekonstruktion der z-Serie Bildstapeln durch konfokale Bildgebung erhalten, in dreidimensionale Darstellungen ermöglicht Visualisierung von kollektiv eindringenden Stränge und Analyse der Darstellung von fluoreszenzmarkierten Zellen in führenden gegenüber folgenden Positionen.
1. Retrovirale Markierung von Zellen mit fluoreszierenden Proteinen
2. Inverse Matrigel Invasion Assays
3. Färbung und Visualisierung
4. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für eine Z-Serie von optischen Schnitten ist in Abbildung 3A gezeigt. In diesem Fall wurden die Zellen mit Calcein AM angefärbt und die Anzahl der Zellen eindringen aus dem Filter zu sehen, mit Abstand zu verringern. Die Quantifizierung der invasion kann durch die Analyse des Verhältnisses von Calcein AM positive Pixel, negative Punkte bei jedem Intervall, oder über die Fixierung / Färbemethode oben beschriebene Zählen PI positiven Kerne an jeder Position möglich. Ein Vorteil von Calcein AM Färbung ist, dass 3-dimensionale Rekonstruktion der Zellinvasion zusammengebaut mit einer Software wie Volocity, was eine visuelle Darstellung der Modus der Invasion (Abbildung 3B) werden. Wenn Zellen durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen markiert sind, dann die Positionen der einzelnen Farben Zelle kann in 3-dimensionale Rekonstruktion visualisiert, entweder von der Seite (Abbildung 3C) oder durch Schnitte durch die Rekonstruktion (Abbildung 3D) angesehen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritte beim Aufbau einer inversen Invasion Assay beteiligt. A) Matrigel ECM auf Eis aufgetaut. B) Matrigel ist 1:1 mit PBS, das jede medikamentöse Behandlung mit der doppelten Endkonzentration verdünnt. C) Transwell-Einsätze sind in Mikrotiterplatten gegeben und Matrigel in jede pipettiert. D) Zellsuspensionen hergestellt in der gewünschten Konzentration. E) Nach dem Matrigel gesetzt hat, die Platte umgedreht ist und entfernt werden, werden die Zellen auf die Unterseite Filter der Transwell-Einsätze vernickelt. F) In der invertierten Position ist das mehrlagig Platte vorsichtig über Transwell-Einsätze platziert, in Kontakt mit der Zellsuspension. G) Zellen werden dürfen, um den Filter für 4 Stunden einzuhalten.
Abbildung 2. Fortführung der Schaltplan für die inverse Invasion Assay. A) Wenn Zellen eingehalten haben, tauchen jede Transwell in serum-freien Medien zweimal zu verlieren Zellen zu entfernen. B) Ort gewaschen Transwell in eine endgültige und mit Medien sowie Behandlungen nach Bedarf. C) Medien mit Lockstoff (zB 10% fötalem Rinderserum) mit Behandlungen nach Bedarf wird vorsichtig auf Matrigel geschichtet.
Matrigel Invasion Assays wurden traditionell mit Zellen auf eine Schicht aus extrazellulären Matrix-Proteins mit Lockstoff-induzierten Motilität in Richtung und durch einen Filter am unteren Rand platziert gesetzt. Invasivität wurde als Funktion der, wie viele Zellen könnte auf der Unterseite des Filters gezählt werden gewertet. Obwohl praktisch gibt es kaum einen Unterschied mit dem "inverse" Invasion Assay beschrieben, gibt es wesentlich mehr Informationen über den Prozess der Invasion, die durch die V...
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Die Finanzierung dieser Forschung ist von Cancer Research UK.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
---|---|---|---|
DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) | GIBCO | 21969 | |
Fetal Bovine Serum | PAA | A15-101 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 | |
200 mM L-Glutamin (100x) | GIBCO | 25050-032 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
0,05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
6.5mm Transwells, 8,0 um Porengröße | Corning | 3422 | |
Komplette Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
Calcein AM | Invitrogen | C1430 | |
RNase | Qiagen | 19101 | |
Propidiumiodid | Sigma-Aldrich | P4864 | |
Konfokale microcope | Leica | SP2MP |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten