모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

요약

입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더 반영 생체내에 상황. 찬란 - 라벨 세포, 침략 모드와 세포를 선도 대 다음의 뚜렷한 공헌에 대한 자세한 정보 공촛점 이미지와 함께 매트릭스 침공 assays를 사용하는 것은 얻을 수 있습니다.

초록

암 강한 악의의 정의 특징은 침략과 전이 ^1입니다. 일부 암 (E. g. glioma ²⁾ 건강한 조직을 주변에 지방 침공에서 질환과 사망의 근본 원인입니다. 다른 암에 대한 (E. g. 유방, 폐, 등.) 그것이 종양 세포가 일차 종양 질량의 이동 말초 사이트를 식민지 궁극적으로 기관 고장에 기여하는, 전이의 과정입니다, 그건 결국 병적 상태에 이르게하고 사망률 ^3. 그것은 침략과 전이는 암 사망자 ^4의 90 %에 대한 책임 것으로 추정되었습니다. 그 결과, 개선 진단과 치료 ⁵ 목적에 대한 분자 프로세스와 침략과 전이의 중요한 단백질 중재자을 식별에 강렬한 관심이있다.

암 과학자에 대한 도전은 충분히의 생체내 상황과 유사한 침공 assays을 개발하는 것입니다정확한 질병 모델링 ⁶ 설정하려면 다음과 같이하십시오. 2 차원 세포 운동성의 assays은 침략의 유익에 대해서만 부분입니다 또한 중요한 요소이다 계정 세포외 기질 (ECM) 단백질 리모델링 고려하지 않습니다. 최근 연구는 종양 세포 침공에 대한 우리의 이해를 세련되고 각 세포는 길쭉한 또는 반올림 모드 ⁷ 이동할 수 밝혔다. 또한, 암 ⁸ 확산에 특히 상피 특성을 유지하는 것을 매우 차별화된 종양의 세포가 긴, 시트와 클러스터로 나눠야하는 공동 침략의 기여보다 감사를,,, 거기되었습니다.

우리는 집단 침략 ¹⁰ 후보 단백질의 공헌을 조사를위한 세련된 방법 ⁹ 현재. 특히, 다른 형광 단백질을 표현하는 세포 공학 별도의 수영장으로, 그것은 molecularly 활동과 protei을 해부하다 할 수 있습니다NS는 다음과 세포에 필요한 그 간의 주요 세포에 필요합니다. RNAi의 사용은 실험적으로 개별 셀 침공뿐 아니라 공동 침략의 다른 위치에 관련된 프로세스를 분해하는 분자 도구를 제공합니다. 이 절차에서는 찬란 - 레이블 세포의 혼합물은 이전 Matrigel ECM 단백질 가득 Transwell 삽입의 하단에 도금되어 다음 필터를 통하여 Matrigel에 "이상"을 침공 수있었습니다. 입체 표현으로, 공촛점 이미징에서 얻은 Z 시리즈 이미지 스택의 재건 위치를 선도하는 대 다음에 찬란 - 레이블 세포의 표현의 총칭 침해 가닥 및 분석의 시각화를위한 수 있습니다.

프로토콜

1. 형광 단백질과 세포의 Retroviral 라벨링

1. 0.25 X 10 ⁶ 세포에 따라 잘 6 잘 밖으로 플레이트 retroviral 포장 셀 (예 : 피닉스) 10% 태아 소 혈청 (FBS) / DMEM에 요리.
2. 48시간 나중에 retroviral DNA와 Transfect 세포 세포는 제조 업체의 지시에 따라 Effectene를 사용하여.
3. 나중에 중간 24시간로 두 번 우물 린스 후 10% 잘마다 FBS / DMEM의 1.5 ML를 추가합니다.
4. pipetting 2 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송하여 중간 48시간 나중에 조직 문화에 패키지 바이러스를 수집합니다.
5. 펠렛 모든 세포로 5 분 1,600 rpm으로 원심 분리기.
6. -80에서 깨끗한 튜브에 뜨는하고 저장 제거 ° C.
7. retrovirally transduced하는 세포 6 잘 요리 잘 당 1.5 × 10 ⁵ 세포에서 밖으로 도금 37 ° C 하룻밤에 humidified 배양기에 배치됩니다.
8. 그 다음날, 세포와 광고에서 미디어를 제거D 각 잘 4 μl polybrene (2 MG / ML)와 보충 바이러스 주식 1 ML. 인큐베이터에서 번호판을 교체하십시오.
9. 5~6시간에 대한 부화 다음 각 잘 ~ 2 ML에게 10% FBS / DMEM을 추가하고 플레이트는 ° C inbubator 밤새 37 대체됩니다.
10. 그 다음날, 미디어를 교체하고 적절한 선택 미디어를 추가하기 전에 세포를 24 시간을 허용합니다.
11. 합류 (성장 세포의 비율과 retroviral 형질 도입의 효율성에 달려있는,하지만 일반적으로 4-14일에서 소요) 때, 참고로 비 transduced 사용하는 형광 세포에 대한 세포 및 정렬 trypsinize와 함께 수집하고 수영장 세포 형광 -80시 비 transduced 셀 및 동결 aliquots보다 큰 ° C 나중에 사용하기 위해.

2. 역 Matrigel의 침공 분석

1. 얼음이 천천히 (그림 1A)에 완료 Matrigel (즉, 성장 요인을 포함)의 나누어지는을 녹여.
2. 얼음 차가운 PBS에 일단 사인을 알아낼 수 없을, 희석 Matrigel 1시 1분 (다른 추가와 함께이전 희석하기 위해 PBS에 2 배 농도에서 치료, 그림 1B). 쉽게 중합 전에 Matrigel을 처리할 수 있도록하려면 모든 plasticware (예 : 팁, 튜브 등) 얼음 차가운해야합니다.
3. uncoated 많은 8 미크론 구멍 6.5 mm 직경이 같은 24 물론 조직 문화 판의 우물에 필요한 Transwells로 넣은 후 조심스럽게 우물에 희석 Matrigel 100 μl를 피펫과 37 ~ 30 분 대한 부화 휴가 ° C가 응고하기 (그림 1C).
4. 이 기간 동안 준비 하나 이상의 찬란 - 라벨이 자신의 정상적인 성장의 각 사전 처리 조건 (E. g. siRNA, 약물 치료)에서 세포 라인에 따라 ML 당 4-1 사이 × 10 ⁵ 세포에서 세포 정지를 중간 (그림 1D).
5. Matrigel은 필터 (그림 1E)의 위를 향하게 아래쪽에 Transwells와 세포 현탁액의 피펫 100 μl 반전, 확정했을 때.
6. 조심스럽게 24 잘 조직의 기본으로 Transwells을 커버문화 플레이트, 세포 현탁액 (그림 1 층)의 각 소적 교신.
7. 세포 부착 (그림 1G)에 대한 허용 4 시간 동안 거꾸로 상태로 접시를 품어.
8. 이번 다음, 접시 오른쪽 접속 설정 및 2 × 1 ML 혈청 무료 매체 (그림 2A)에 순차 수영 각 Transwell 씻는다.
9. (그림 2B) 잘 필요한 의약품이나 치료를 포함하는 3 번째 Transwells를 남겨주세요.
10. 부드럽게 경화 Matrigel / PBS 혼합물 위에 Transwell에 (25 NG / ML에서 E. g. EGF) FBS / DMEM 플러스 chemoattractant 10 % 100 μl를 피펫, 37 3-5일 위해 뚜껑과 부화를 교체 ° C와 5 % CO ₂ (그림 2C).

3. 얼룩 및 시각화

1. 형광 단백질을 표현하는 세포는 사전 공촛점 현미경하려면 다음 단계를 건너뛸 수 있습니다
2. 신선한 24 잘 요리와 4 μm의의 피펫 1 ML에서 Matrigel, 장소 Transwells를 침해 이미지가 아닌 형광 세포Calcein는 측면을 통해 누설하고 상단과 하단에서 얼룩 수 있도록, 각 Matrigel 플러그 상단에 얼룩 솔루션입니다. Calcein AM (calcein의 아세 톡시 메틸 에스테르)는 얼룩이 전체 전지 그린 라이브 세포 염색이며 고정이 필요하지 않습니다.
3. 37 1 시간 품어 ° C 5 % CO의 포인트 세포가 완전히 스테인드 및 공촛점 현미경으로 몇 군데 준비하는 ₂ humidified 분위기.
4. 또는, Matrigel을 침해하지 않는 형광등 전지는 고정 및 3.9-3.5에서 아래에 설명된대로 스테인드 수 있습니다.
5. 신선한 24 잘 플레이트 각 Transwell을 전송합니다. 오버레이 4% para-formaldehyde/0.2 % 트리톤 X - 100 1 ML.
6. 0.5 시간 동안 실온에서 품어.
7. 정착액을 제거하고 1 ML PBS로 3 회 씻는다.
8. 100 μg / ML RNase를 사용하여 30 분 RNase 처리와 세포질 RNA를 제거합니다. PBS로 2 번 씻으십시오.
9. 시각화를위한 PBS에 희석 0.01 밀리그램 / ML Propidium 요오드화물의 (PI)을 추가하고 DA의 실온에서 떠나0.5 시간 RK. PBS로 3 회 씻는다. 이 단계에서, PI는 transwell 적어도 1 개월 어두운 실온에서 보관 수 있습니다 얼룩.
10. 공촛점 현미경으로 정밀 이미징 방법을 사용할 수있는 리소스에 의존하고 있습니다. 비 침지 20 X 객관적이고 광학 섹션에게 matrigel 플러그의 바닥에서 모든 10-15 μm의를 캡처 이상의 대형 coverslip에 잔류 PBS의 소량 (어떤 거품이 존재하지 않습니다 확인)로 거꾸로 공촛점 현미경, 장소 Transwell을 사용합니다. 개별 광학 조각은 침략의 범위 (그림 3A)를 수치 또는 Volocity 적절한 소프트웨어 (그림 3B)를 사용하여 3 차원 물체에 빌드하는 데 사용할 수 있습니다.

4. 대표 결과

광학 조각의 Z 시리즈의 예제는 그림 3A에 표시됩니다. 이 경우, 전지가 Calcein 오전 물들일되었으며 필터에서 최대 침해 세포의 숫자는 거리와 감소 볼 수 있습니다. 에의 부량vasion는 Calcein의 비율은 각 간격에서 이상 자세한 고정 / 얼룩 방법을 사용하여 각 위치에서 PI 긍정적인 핵 계산에 의해 부정적인 픽셀 긍정 픽셀 오전 분석하여이 작업을 수행할 수 있습니다. Calcein 중 하나 장점은 얼룩 AM 세포 침공의 3 차원 reconstructions는 침략의 모드 (그림 3B)의 시각적 묘사를 제공 같은 Volocity와 같은 소프트웨어를 사용하여 조립하실 수 있습니다. 세포는 형광 단백질의 표현에 의해 표시하는 경우에는 다음 각 색상 세포의 위치는 어느쪽으로 (그림 3C) 또는 재구성 (그림 3D)를 통해 조각하여 볼, 3 차원 reconstructions에 시각하실 수 있습니다.

그림 1. 역 침해 분석 설정에 관련된 단계 도식 다이어그램. A) Matrigel ECM 얼음이 해동. B) Matrigel은 PBS 두번 최종 농도가 언제 약물 치료를 포함하는와 1시 1분을 희석 수 있습니다. C) Transwell 삽입은 multiwell 접시에 배치하고, Matrigel은 각에 pipetted 수 있습니다. D) 셀 정지가 원하는 농도에했다. E) Matrigel이 설정되면, 접시는 거꾸로하여 제거, 세포는 Transwell 삽입의 아래쪽 필터에 도금입니다. F) 거꾸로 위치에서 multiwall 판은주의 깊게 세포 현탁액과 접촉하고, Transwell 삽입 위에 배치됩니다. G) 세포는 4 시간 동안 필터 준수 사용할 수 있습니다.

그림 2. 침공 반전 분석을위한 설계도 다이어그램의 지속. 세포가 붙어있다) 일단, 두 번 풀어 세포를 제거하는 혈청이없는 미디어로 각 Transwell을 찍어. B) 장소가 필요한 최종 잘 들어있는 미디어 플러스 트리 트먼트로 Transwell을 빨기도 했죠. C) 미디어 필요한 트리 트먼트 chemoattractant (예 : 10% 태아 소 혈청)이있는가 신중하게 Matrigel에 계층입니다.

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그림 3. 인버스 침해 분석 결과의 대표 이미지. A) Calcein 물들일 세포의 광학 섹션 공촛점 현미경으로 15 μm의 간격으로 촬영 Matrigel을 침해입니다. 측면에서 볼 공촛점 Z - 시리즈 이미지의 스택에서 세포 침공의 3 차원 재건의 B) 재건. 참조 ¹⁰ Reprinted. 측면에서 볼 Matrigel을 침해 GFP 및 RFP - 라벨 세포 C) 3 차원 재건. GFP 및 RFP - 라벨 세포의 3 차원 재건을 통해 D) 광학 조각. 참조 ¹⁰ Reprinted.

토론

Matrigel의 침공 assays는 전통적으로 chemoattractant 유발 운동성와 세포외 기질 단백질의 레이어로하고 하단에있는 필터를 통해 배치 전지로 설정되었습니다. Invasiveness는 필터의 아래쪽에 계산 될 수 얼마나 많은 세포의 기능으로 득점했다. 위에서 설명한 "반전"침략 분석과 함께 약간의 차이가 거의가 있지만, 그들이 Matrigel 통해 이동하고 침입 세포를 시각화하여 확인할 수 침략의 프로세스에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
DMEM (Dulbecco의 변형 이글 배지)	GIBCO	21,969
태아 소 혈청	PAA	A15 - 101
페니실린의 스트렙토 마이신	GIBCO	15,140
200 MM L - 글루타민 (100x)	GIBCO	25050-032
Puromycin	시그마 - 올드 리치	P8833
0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	GIBCO	25,300
Polybrene	시그마 - 올드 리치	AL - 118
Lipofectamine 2,000 시약	Invitrogen	11668019
6.5mm Transwells, 8.0 μm의 기공 크기	코닝	3422
완료 Matrigel	BD Biosciences	354,234
Calcein AM	Invitrogen	C1430
RNase	Qiagen	19,101
Propidium 요오드화물의	시그마 - 올드 리치	P4864
공촛점 microcope	Leica	SP2MP