Моделирование и обработка изображений 3-мерная коллективной Вторжение сотовый

Резюме

Модели инвазии опухоли клетки в трехмерном внеклеточного матрикса лучше отражать В естественных условиях Ситуацию, чем двумерные анализов подвижности. Использование матрицы вторжения тестов в сочетании с конфокальной микроскопии флуоресцентно-меченых клеток, подробную информацию о вторжении режимы и конкретный вклад ведущих против следующих клетки могут быть получены.

Аннотация

Определяющей характеристикой рака злокачественности инвазии и метастазирования ^1. В некоторых видов рака (д г. Глиомы ^2), местной инвазии в окружающие здоровые ткани является основной причиной болезни и смерти. Для других видов рака (д г. Молочной железы, легких и т.д..), То процесс метастазирования, в котором клетки опухоли перейти от основной массы опухоли, колонизировать дистальных участках и в конечном счете способствовать отказу органов, которые в конечном итоге приводит к заболеваемости и смертности ^3. Было подсчитано, что инвазии и метастазирования несут ответственность за 90% смертей от рака ^4. В результате, наблюдается повышенный интерес в выявлении молекулярных процессов и критических посредников белка инвазии и метастазирования в целях улучшения диагностики и лечения ^5.

Задача ученых рака является развитие вторжения анализов, которые достаточно похожи в естественных условиях ситуациячтобы точного моделирования болезни ^6. Двумерные анализов клеточной подвижности носят информативный об одном аспекте вторжения и не принимают во внимание внеклеточного матрикса (ECM), белка ремоделирования, который также является важным элементом. В последнее время исследования изысканные наше понимание опухолевой инвазии клеток и показали, что отдельные клетки могут перемещаться по удлиненные или округлые режимах ^7. Кроме того, было оценить ее вклад коллективного вторжения, при котором клетки вторгнуться в нити, листы и кластеры, особенно в наиболее дифференцированных опухолей, которые поддерживают эпителиальных характеристики, распространение рака ^8.

Мы представляем более совершенный метод ⁹ для изучения вклада кандидата белков коллективного вторжения ^10. В частности, на основе технического отдельные пулы клеток, чтобы выразить различные флуоресцентные белки, можно молекулярно анализировать деятельность и Протейнс требуется в ведущих клетки против тех, которые требуются в следующих клеток. Использование РНК-интерференции обеспечивает молекулярный инструмент для экспериментально разбирать процессы, связанные с отдельными вторжения клеток, а также в различных положениях коллективного вторжения. В этой процедуре, смеси флуоресцентно-меченых клеток высевали на нижней части вставки Transwell ранее заполненную белка Матригель ECM, то разрешено вторгаться "вверх" через фильтр и в Матригель. Реконструкция Z-серии изображений стеки, полученные конфокальной микроскопии, в трехмерных представлений позволяет для визуализации коллективно вторжения пряди и анализ представления флуоресцентно-меченых клеток в сравнении с ведущими следующие позиции.

протокол

1. Ретровирусные маркировки клеток с флуоресцентными белками

1. Пластина ретровирусных клетки тары (например Phoenix) из уровне 0,25 х 10 ^{6 клеток} на лунку 6-а блюдо в 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) / DMEM.
2. Трансфекции клеток с ретровирусной ДНК через 48 часов клетки, используя Effectene в соответствии с инструкциями производителя.
3. Промыть скважин в два раза со средней через 24 часа, затем добавьте 1,5 мл 10% FBS / DMEM на лунку.
4. Сбор упакованных вирусов в культуре ткани средой через 48 часов с помощью пипетки и передачи до 2 мл пробирок микроцентрифужных.
5. Центрифуга при 1600 оборотов в минуту в течение 5 мин для осаждения любой клетки.
6. Удалить супернатант в чистую пробирку и хранить при температуре -80 ° C.
7. Клетки должны быть retrovirally трансдуцированных высевают из на уровне 1,5 х 10 ^{5 клеток} на лунку 6 хорошо блюдо и помещен в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение ночи.
8. На следующий день, удаление информации из клетки и объявленияг 1 мл вируса фондовом дополнена 4 мкл polybrene (2 мг / мл) в каждую лунку. Замените пластин в инкубаторе.
9. После инкубации в течение 5-6 часов, добавляют 2 мл 10% FBS / DMEM в каждую лунку и плиты заменяются в 37 ° C inbubator ночь.
10. На следующий день, заменить средства массовой информации и позволяют клеткам 24 часов перед добавлением соответствующих селективных средах.
11. При сливной (которая зависит от скорости роста клеток, а эффективность ретровирусной трансдукции, но обычно занимает от 4-14 дней), trypsinize клеток и сортировки для флуоресценции с использованием не-трансдуцированных клетки в качестве эталона, собирать и объединять ячейки с флуоресценции больше, чем не трансдуцированных клетки и заморозить порциями при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.

2. Обратные вторжения Матригель анализа

1. Медленно оттепели аликвоту полный Матригель (т.е. содержащие факторы роста) на льду (рис. 1А).
2. Как только размороженные, развести Матригель 1:1 в ледяной PBS (наряду с любыми другими дополнительнымипроцедуры в 2 раза концентрации в PBS до разведения, рисунок 1В). Чтобы было легче обращаться Матригель до полимеризации, все Пластик (например, советы, трубы и т.д.) должна быть ледяной.
3. Вставить как многие 8 микрон поры диаметром 6,5 мм без покрытия Transwells по мере необходимости в лунки 24-луночного планшета культуры ткани, затем осторожно пипеткой по 100 мкл разбавленного Матригель в лунки и оставить для инкубации в течение ~ 30 минут при 37 ° С укрепить (рис. 1в).
4. За это время подготовить один или несколько флуоресцентно меченных клеточные суспензии составляет от 1 до 4 х 10 ⁵ клеток на мл, в зависимости от клеточной линии, каждая из предварительно обработанных условие (е г. МиРНК, лечение) в их нормального роста средой (рис. 1D).
5. Когда Матригель укрепил, инвертировать Transwells и пипетки 100 мкл клеточной суспензии на лицевой стороной вверх нижней фильтра (рис. 1E).
6. Осторожно крышка Transwells с базой 24 и тканикультуры пластины, соприкасающиеся с каждой капли суспензии клеток (рис. 1F).
7. Инкубируют пластинки в перевернутом состоянии в течение 4 часов, чтобы позволить для сотовых вложений (рис. 1С).
8. После этого времени, включите пластинами лицевой стороной вверх и мыть каждый Transwell путем последовательного погружения в 2 х 1 мл сыворотки среде без (рис. 2A).
9. Оставьте Transwells в третьей скважины, содержащие любые лекарства или процедур, необходимых (рис. 2В).
10. Аккуратно пипетки 100 мкл 10% FBS / DMEM плюс хемоаттрактант (e. г. ЭФР при 25 нг / мл) в Transwell поверх затвердевшего Матригель / PBS смеси, закрыть крышкой и выдержать в течение 3-5 дней при температуре 37 ° C с 5% CO ₂ (рис. 2С).

3. Окрашивание и визуализации

1. Клетки, экспрессирующие флуоресцентные белки можете пропустить шаги до конфокальной микроскопии
2. Чтобы создать образ не-флуоресцентные клетки вторжения Матригель, Transwells место в свежем 24 также блюда и пипетки 1 мл 4 мкМКальцеин AM пятно решение на верхней части каждой Матригель разъем, что позволяет ему перекинуться сторон и пятна от верхней и нижней. Кальцеин AM (ацетоксиметил эфир кальцеин) является живой красителем ячейки, пятна все клетки зеленой и не требует фиксации.
3. Инкубируйте 1 час при 37 ° С в 5% CO ₂ влажной атмосфере, после чего клетки полностью окрашенных и готовы для включения в образ с помощью конфокальной микроскопии.
4. Кроме того, не-флуоресцентные клетки вторжения Матригель может быть фиксированным и окрашивают, как описано ниже в 3,5 до 3,9.
5. Передача каждого Transwell на свежем 24-луночного планшета. Наложение 1 мл 4% para-formaldehyde/0.2% Triton-X 100.
6. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 0,5 часа.
7. Удалить фиксатор и промыть 3 раза с 1 мл PBS.
8. Удалить цитоплазматической РНК с 30 мин РНКазы лечение с использованием 100 мкг / мл РНКазы. Мыть 2 раза с PBS.
9. Для визуализации добавить 0,01 мг / мл пропидия йодидом (PI) разводят в PBS и оставить при комнатной температуре в датк в течение 0,5 часа. Промыть 3 раза PBS. На данном этапе, П. И. окрашенных transwell может храниться при комнатной температуре в темном месте не менее 1 месяца.
10. Точные методы визуализации с помощью конфокальной микроскопии зависит от имеющихся ресурсов. Использование перевернутого конфокальной микроскопии, место Transwell с небольшим количеством остаточного PBS на большие покровное (убедиться в отсутствии пузырьков присутствуют) по непогружения 20 X объективных и захвата оптических срезов каждые 10-15 мкм со дна Матригель вилку. Индивидуальные оптические ломтиками могут быть использованы для количественной степени инвазии (рис. 3А) или строить в 3-мерных объектов с помощью соответствующего программного обеспечения, таких как Volocity (рис. 3В).

4. Представитель Результаты

Пример Z-серия оптических ломтиками показан на рисунке 3А. В этом случае клетки окрашивали кальцеин утра и количество клеток до вторжения из фильтра можно увидеть уменьшается с расстоянием. Количественная оценка вvasion можно сделать, анализируя отношение кальцеин уверен пикселей к негативным пикселей в каждом интервале, либо с помощью фиксации / окрашивания методом описано выше и подсчет PI положительных ядер в каждом положении. Одним из преимуществ кальцеин AM окрашивания в том, что 3-мерных реконструкций клеточных вторжения могут быть собраны с использованием программного обеспечения, таких как Volocity, давая визуальной информации о способе вторжения (рис. 3В). Если клетки помечены выражение флуоресцентные белки, то позиции каждого цвета ячейки могут быть визуализированы в 3-мерной реконструкции, либо сбоку (рис. 3C) или путем рассекает реконструкции (рис. 3D).

Рисунок 1. Принципиальная схема этапов в создании обратной анализа вторжения. ) Матригель ECM талых на льду. Б) Матригель разводят 1:1 с PBS, содержащий любой лекарственной терапии, в два раза конечной концентрации. С) Transwell вставки помещаются в пластинах многоямного и Матригель пипеткой в ​​каждую. D) Суспензии клеток, принятых на желаемой концентрации. Е) После Матригель установил, пластины инвертируется и удаляются, клетки высевают на нижней фильтр вставки Transwell. F) в перевернутом положении, многослойные пластины осторожно помещают над вставками Transwell, что делает контакт с клеточной суспензии. G) Клетки имеют право придерживаться фильтра в течение 4 часов.

Рисунок 2. Продолжение схема для обратного анализа вторжения. А) Как только клетки присоединились, окуните каждый Transwell в бессывороточной СМИ дважды, чтобы удалить свободные клетки. Б) Место мыть Transwell в окончательном хорошо средах плюс процедуры по мере необходимости. C) Среды, содержащие хемоаттрактант (например, 10% эмбриональной телячьей сыворотки) с лечения в соответствии с требованиями тщательно слоистых на Матригель.

ЛОР ">
Рисунок 3. Представителю изображения результатов анализа обратной вторжения. ) Оптический участки клеток, окрашенных кальцеин AM вторжения Матригель, принятые на 15 мкм интервалы с помощью конфокальной микроскопии. Б) Реконструкция 3-мерной реконструкции ячейки вторжения из стопки конфокальной Z-серии изображений, смотреть со стороны. Перепечатано из ссылки ^10. C) Трехмерная реконструкция GFP и RFP-меченых клеток вторжения Матригель смотреть со стороны. D) оптический срез через 3-мерной реконструкции GFP и RFP-меченых клеток. Перепечатано из ссылки ^10.

Обсуждение

Анализы Матригель вторжения традиционно были созданы с клетками помещали на слой внеклеточных белков матрицей с хемоаттрактант вызванных моторики навстречу и через фильтр, в нижней части. Инвазивности был забит как функция, сколько ячеек можно было пересчитать по нижней стороне филь...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
DMEM (Medium Дульбеко изменения Орла)	GIBCO	21969
Эмбриональной бычьей сыворотки	ПАА	А15-101
Пенициллин Стрептомицин	GIBCO	15140
200 мМ L-глутамина (100x)	GIBCO	25050-032
Пуромицин	Sigma-Aldrich	P8833
0,05% трипсина ЭДТА	GIBCO	25300
Polybrene	Sigma-Aldrich	AL-118
Lipofectamine 2000 реагентов	Invitrogen	11668019
6,5 мм Transwells, 8,0 мкм размер пор	Гранулирование	3422
Полное Матригель	BD Biosciences	354234
Кальцеин AM	Invitrogen	C1430
РНКазы	Qiagen	19101
Пропидия йодидом	Sigma-Aldrich	P4864
Конфокальной microcope	Leica	SP2MP