Ganze Glaskörper Dissection für Vitreodynamic Analysis

Zusammenfassung

The goal of this protocol is to show an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes.

Zusammenfassung

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous studies have shown the results of such dissections, the detailed steps have not been described, precluding researchers outside the field from replicating their methods. Other studies harvest vitreous either through aspiration, which does not maintain the vitreous structure anatomy, or through partial dissection, which only isolates the vitreous core. The proposed method isolates the whole vitreous body, with the vitreous core and cortex intact, while maintaining vitreous anatomy and structural integrity. In this method, a full thickness scleral flap in an enucleated porcine eye is first created and through this, the choroid tissue can be separated from the sclera. The scleral flap is then expanded and the choroid is completely separated from the sclera. Finally the choroid-retina tissue is peeled off the vitreous to leave an isolated intact vitreous body. The proposed vitreous dissection technique can be used to study physical properties of the vitreous humor. In particular, this method has significance for experimental studies involving drug delivery, vitreo-retinal oxygen transport, and intraocular convection.

Einleitung

Das Ziel dieser Methode ist es, detaillierter eine Technik, um eine ganze, intakte Glaskörper zu isolieren, mit dem glasartigen Kern und Cortex intakt von einem kadaver Auges, für die Zwecke der vitreodynamic Analyse. Da der Bereich der Glaskörper Physiologie hat, multidisziplinären Forscher, wie der Strömungsmechanik Forscher geworden, untersuchen die physikalischen und biomechanischen Eigenschaften des Glaskörpers ^1. Zu diesem Zweck ist es wesentlich, detailliert eine Technik, die ganze, intakte Glaskörper zu isolieren, um multidisziplinäre Forscher unterstützen.

Sebag et al. ² und ³ durchgeführt, andere elegant ganze Glaskörper Dissektionen auf menschliche kadaver Augen und zeigte Darstellungen der Ergebnisse. Jedoch wurde die Technik verwendet, nicht im Detail, und Nicht-Experten beschrieben nicht in der Lage ist, das Verfahren unabhängig replizieren. Andere Studien haben Glaskörper aus kadaver Augen mit einfacheren Methoden wie Aspiration oder Teilzerlegung geerntet,von denen beide nicht in eine ganze, intakte Glaskörper führen. Gisladottis et al. ⁴ und Xu et al. ⁵ zu untersuchen Lässigkeit in Glaskörper aus kadaver Augen geerntet. Da jedoch kein Verfahren aus glasartigem Extraktion wurde beschrieben, wurde angenommen, daß sie die Glaskörperflüssigkeit mit einer Spritze abgesaugt. Watts et al. ⁶ ging noch einen Schritt weiter, indem ein Verfahren zur Isolierung Kaninchen Glaskörper mit einem Operationstechnik beschreibt. Führt dieses Verfahren jedoch in einer Isolation von nur dem Glaskern und dem Glaskörper nicht. Skeie et al. ⁷ später organisierte den Glaskörper in 4 einzigartigen Regionen und ein Verfahren beschrieben, um jeden Teil zur Analyse sezieren elegant. Diese Technik jedoch nicht in einer intakten Glaskörper als Ganzes führen.

Die aktuelle Technik wurde entwickelt, um die biophysikalischen Experimenten, die derzeit nur in kadaver Augen durchgeführt werden, zu erleichtern. Früheren Verfahren, beschrieben alsBove, sind begrenzt, da 1) keine die gesamte Glaskörper vollständig zu isolieren, 2) geerntet glasigen Kern und Cortex homogenisiert, 3) glasartigen anatomischen Struktur nicht beibehalten wird, oder 4) Dissektion Techniken sind nicht ausreichend für die Replikation von Forschern in anderen Bereichen detailliert . Darüber hinaus aufgrund der Opazität des Sklera und Aderhaut, die Visualisierung des Glaskörpers in der intakten Augapfels beschränkt. Dies begrenzt die Genauigkeit und Realisierbarkeit von Messungen, die innerhalb des ganzen Auges gemacht werden können. Zusätzlich können die anatomischen Strukturen umgebenden Glaskörper das Studium der biochemischen und physikalischen Eigenschaften der glasartigen verwechseln.

In den letzten Jahren hat der Körper aus glasartigem Wissenschaft enorm gewachsen und es gibt Grund zu glauben, dass die gesamte Glaskörper hat andere Eigenschaften als ihre Einzelteile. Es gibt ein wachsendes Interesse bei der Untersuchung der physikalischen, biomechanische und chemischen Eigenschaften des Glaskörpers für vitreodynamics research, die Anwendungen in der klinischen Medizin, wie Arzneimittelabgabe, intravitreale Sauerstoffversorgung ⁸ und Vitrektomie hat. Pharmakologische vitreodynamics, das pharmakologische Mittel verwendet, um den Glaskörper zu manipulieren, können zur Vitrektomie Ergebnisse ⁹ zu verbessern. Biomechanischen Eigenschaften verwendet werden, um glasartige Fluidströmung, die verwendet werden können zur Verbesserung der intravitrealen Darreichungsformen ^10-12 modellieren. Die physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Segmente des Glaskörpers sind entscheidend für das Verständnis vitreoretinalen Sauerstofftransport ^13. Die vorgeschlagene glasigen Dissektionstechnik verwendet, um verschiedene Eigenschaften des intakten Glaskörper zu untersuchen. Es ermöglicht Tischexperimente auf ganze, intakte Glaskörper mit besseren Visualisierung erfolgen.

Zusammenfassend aktuellen Methoden zur Untersuchung des Glaskörpers sind entweder nicht hinreichend beschrieben, oder führen zu einer unvollständigen Trennung der Glaskern und Kortex. Daher besteht ein Bedarf, e auszuführenXperiments in einem transparenten Augenmodell unter Beibehaltung der Anatomie des Glaskörpers, die im kadaver Auge vorliegt.

Protokoll

Alle Augen enukleiert wurden von einem Schlachthaus erhalten, und alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Biosicherheit Gesetze durchgeführt.

1. Sichere entkernte Auge nach unten auf eine Oberfläche. Tun Sie dies, indem Gewebestifte durch das überschüssige Gewebe um das Auge herum und befestigen Sie sie nach unten in eine Styroporplatte.
2. Sezieren und nehmen perilimbal Bindehaut aus dem Auge.
   1. Verwenden feinen Pinzette (0.3 Pinzette) und Mikroschere (Westcott Schere), die Bindehaut am Limbus einzuschneiden und stumpf sezieren von der Lederhaut. Schneiden Sie die Bindehaut entlang des Limbus, wie der stumpfe Präparation schreitet weiter Dissektion ermöglichen.
   2. Entfernen Binde ganzen Weg rund um das Auge (360 Grad), um so viel wie möglich Sklera freizulegen.
      HINWEIS: Es ist hilfreich, eine kleine Menge von Bindehaut zu verlassen, um zu erleichtern Fixierung des Auges mit den chirurgischen Stiften oder einer Pinzette während der Rest des Verfahrens.
3. Erstellen Sie eine volle Dicke Skleralappen entlang einerSeite des Auges (Skalpellklinge 69).
   1. Einen ~ 5 mm Skleraeinschnitt parallel zum Limbus und 3 mm hinter dem Limbus durch leichtes Einschneiden der Sklera mit dem Skalpell (Skalpell 11) bis dunkel pigmentierten Chorioidea sichtbar. Achten Sie darauf, die Aderhaut selbst einzuschneiden.
   2. Sorgfältig seziert entlang der Ebene zwischen der Sklera und der Choroidea, entweder mit einer Schere (unter Verwendung stumpf) oder mit dem Skalpell, bis es möglich ist, das Potential Raum zwischen diesen Geweben zu vergrößern, indem der Choroidea sanft nach innen.
   3. Eine weitere Skleraeinschnitt senkrecht zur ersten Skleraeinschnitt mit scharfen Mikroscheren, wodurch eine T-förmige Einschnitt.
   4. Dann weiterhin unverblümt sezieren in Umfangs Mode, um die Skleragewebe von der darunter liegenden Aderhaut zu entfernen, und schieben Sie die Aderhaut weg von der Lederhaut, wie oben erwähnt.
   5. Vergrößern Sie die Lederhautlappen nach Bedarf.
      1. Sanft leckersten Blunt der Aderhaut weg von der Lederhaut zu sezierenwährend des gesamten Prozesses.
      2. Vergrößern der Klappe bis der Schnitt senkrecht zu dem Limbus vorgenommen erreicht den Sehnerv und der Einschnitt parallel zum Limbus ist zumindest ein Drittel des Auges Umfangs (45 °).
      3. Verwenden Sie die Lederhautlappen als Quelle der Hebelwirkung für die Manipulation des Auges während stumpf. Die Gegen Traktion auf der Klappe erleichtert es stumpf.
   6. Wiederholen Sie diesen Schritt auf der anderen Lederhautlappens.
4. Schneiden Sie die Lederhautlappen um einen großen Bereich der Aderhaut freizulegen.
5. Weiterhin den Einschnitt in Schritt 3, die um das Auge des Umfangs (360 Grad) aus.
6. Entfernen Sie die verbleibenden Aderhaut-Retina-Gewebe.
   1. Innerhalb der freigelegten Bereich, mit einem Watte-Spitze vorsichtig abbürsten die verbleibende Aderhaut-Retina-Gewebe. Alternativ sanft greifen das Gewebe mit einer Pinzette und abziehen der darunter liegenden Glaskörper.
   2. Falls erforderlich einen Einschnitt in die Aderhaut starting vom Sehnerven. Dann abziehen der Aderhaut sanft, um die Netzhaut und Glaskörper freizulegen.
7. Weiter stumpfes Sezieren der Aderhaut weg von der Lederhaut und dann abziehen der Aderhaut, die ganze, intakte Glaskörper zu erhalten.
8. Verwenden Sie die Sklerarand an der Hornhaut angebracht, um die gesamte Glaskörper in gewünschten Stelle zu positionieren. An diesem Punkt wird der Glaskörper an der vorderen Sklera und Objektiv.
9. Blunt den Glaskörper von der Innenseite der Sklera zu zergliedern, um die Linse, Entfernen aller Sklera.
10. Verwenden Sie ein stumpfes Werkzeug, um die Linse von der Glaskörper schöpfen, wenn es sein muss. Verwenden Sie die Probe für verschiedene vitreodynamic Experimente.
    1. Man gibt die Probe in einem Becherglas mit bekannter Oberfläche der Luft ausgesetzt. Platzieren Sauerstoff empfindliche Sonde an der Kante der Probe. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Sonde zu einem bekannten Abstand (r) in die Probe zu bewegen.
    2. Verwenden Fickschen Gesetzen der Diffusion, die theoretische Diffusionsgleichung erhalten. Mit dem data in Schritt 10.1 gesammelt, erhalten den experimentellen Diffusionskoeffizient / Reaktionszeit usw.

Ergebnisse

Anlehnung an das Protokoll zu einem erfolgreichen glasigen Dissektion mit dem Kern und Cortex (Abbildung 3) intakt zu führen. Dies ergibt sich aus den Reststücken Retina in den Glas cortex haftet. Intakte ganze Glaskörper kann auf verschiedene Weise für spezifische vitreodynamic Experimente eingesetzt werden. In unserem Fall ist die Diffusionsgeschwindigkeit von Sauerstoff in intakten Glaskörper und entsprechende Zeitkonstante wurde (Figur 2) untersucht. Glaskörper, die präparier...

Diskussion

Es gibt zwei wichtige Schritte, die sorgfältig im Glaskörper Dissektion durchgeführt werden müssen. Schritt 3, der eine gesamte Dicke Lederhautlappen, ist von entscheidender Bedeutung für die gesamte Sektion. Achten Sie darauf, nicht in die Aderhaut schneiden bei der Erstellung der gesamten Dicke Lederhautlappen werden. Die andere wichtige Schritt ist Sezieren entfernt die Lederhaut von der Aderhaut. Dieser Schritt muss sorgfältig durchgeführt werden Erstellen mehrerer Löcher in der Aderhaut, aus der die Glaskö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 forceps	Storz Opthalmics	E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right	Storz Opthalmics	E3320 R
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle	VWR	470174-844