Tutta vitreo Umore dissezione per l'analisi Vitreodynamic

Riepilogo

The goal of this protocol is to show an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes.

Abstract

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous studies have shown the results of such dissections, the detailed steps have not been described, precluding researchers outside the field from replicating their methods. Other studies harvest vitreous either through aspiration, which does not maintain the vitreous structure anatomy, or through partial dissection, which only isolates the vitreous core. The proposed method isolates the whole vitreous body, with the vitreous core and cortex intact, while maintaining vitreous anatomy and structural integrity. In this method, a full thickness scleral flap in an enucleated porcine eye is first created and through this, the choroid tissue can be separated from the sclera. The scleral flap is then expanded and the choroid is completely separated from the sclera. Finally the choroid-retina tissue is peeled off the vitreous to leave an isolated intact vitreous body. The proposed vitreous dissection technique can be used to study physical properties of the vitreous humor. In particular, this method has significance for experimental studies involving drug delivery, vitreo-retinal oxygen transport, and intraocular convection.

Introduzione

L'obiettivo di questo metodo consiste nel dettaglio una tecnica per isolare un intero, corpo vitreo intatto, con il nucleo vitreo e corteccia intatta, da un occhio di cadavere, ai fini dell'analisi vitreodynamic. Poiché il campo della fisiologia del vitreo è cresciuta, i ricercatori multidisciplinari, quali la meccanica dei fluidi ricercatori, stanno studiando le proprietà fisiche e biomeccaniche del corpo vitreo ^1. A tal fine, è indispensabile dettaglio una tecnica per isolare tutto, corpo vitreo intatta per favorire ricercatori multidisciplinari.

Sebag et al. ² e altri ³ eseguiti eleganti intere dissezioni vetrose sugli occhi cadavere dell'uomo e hanno mostrato le illustrazioni dei risultati. Tuttavia, la tecnica utilizzata non è stata descritta in dettaglio e non esperti, non sarebbe in grado di replicare il metodo indipendente. Altri studi hanno raccolto vitreo da occhi cadavere con metodi semplici, come l'aspirazione o dissezione parziale,entrambi i quali non provocano un tutto, corpo vitreo intatto. Gisladottis et al. ⁴ e Xu et al. ⁵ indagare permeabilità nel vitreo raccolte da occhi cadavere. Tuttavia, poiché nessun metodo di estrazione vetrosa è stata descritta, si è ipotizzato che essi aspirati vitreo con una siringa. Watts et al. ⁶ andato un passo avanti descrivendo un metodo per isolare coniglio vitreo con una tecnica chirurgica. Tuttavia, questo metodo provoca un isolamento del solo nucleo vitreo e non la corteccia vitreo. Skeie et al. ⁷ poi organizzato il vitreo in 4 regioni uniche ed elegantemente descritto un metodo per sezionare fuori ogni parte per l'analisi. Questa tecnica tuttavia, non comporta un vitreous intatto nel suo complesso.

La tecnica attuale è stato sviluppato per facilitare esperimenti biofisici attualmente eseguite solo in occhi cadavere. I metodi precedenti, come descritto unbove, sono limitati perché 1) nessuno isolare completamente tutto il corpo vitreo, 2) raccolte nucleo vitreo e la corteccia sono omogeneizzati, 3) vitrea struttura anatomica non è mantenuta, o 4) tecniche di dissezione non sono adeguatamente dettagliate per la replica da parte dei ricercatori in altri campi . In aggiunta, a causa della opacità sclera e della coroide, visualizzazione del corpo vitreo è limitata nel bulbo oculare intatto. Questo limita la precisione e la fattibilità di misurazioni che possono essere fatte all'interno occhio intero. Inoltre, le strutture anatomiche circostanti il ​​vitreo possono confondere lo studio delle proprietà biochimiche e fisiche del vitreo.

Negli ultimi anni, il corpo della scienza vitreo è cresciuto enormemente e non vi è ragione di credere che tutto il corpo vitreo ha proprietà diverse rispetto le sue singole parti. Vi è un crescente interesse per lo studio delle proprietà fisiche, biomeccaniche e chimiche del vitreo per vitreodynamics research, che ha applicazioni in medicina clinica, come la somministrazione di farmaci, l'ossigenazione intravitreale ⁸ e vitrectomia. Vitreodynamics farmacologici, che utilizza agenti farmacologici per manipolare il corpo vitreo, possono essere utilizzati per migliorare i risultati vitrectomia ^9. Proprietà biomeccaniche vengono utilizzate per modellare il flusso di fluido vitreale, che può essere utilizzato per migliorare drug delivery tecnologie intravitreale ^10-12. Le proprietà fisiche di diversi segmenti del vitreo sono cruciali per comprendere vitreo-retinica trasporto dell'ossigeno ^13. La tecnica dissezione vitreo proposto può essere usato per studiare varie proprietà del intatte vitreo. Permette da banco esperimenti da fare su tutto, corpi vetrosi intatti con una migliore visualizzazione.

In sintesi, i metodi attuali per lo studio del vitreo sono o non adeguatamente descritte o causare un isolamento incompleta nucleo vitreo e corteccia. Pertanto, vi è la necessità di eseguire experiments in un modello di occhio trasparente, pur mantenendo l'anatomia del vitreo che esiste negli occhi cadavere.

Protocollo

Tutti gli occhi enucleati sono stati ottenuti da un macello e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le leggi biosicurezza istituzionali.

1. Fissare occhio enucleato in giù su una superficie. A tale scopo, mettendo i perni dei tessuti attraverso il tessuto in eccesso intorno all'occhio e fissandolo in giù in una tavola di polistirolo.
2. Staccare e staccare congiuntiva perilimbare dall'occhio.
   1. Utilizzare una pinza sottile (0,3) e pinze microscissors (forbici Westcott) per incidere la congiuntiva al limbus e senza mezzi termini sezionare fuori la sclera. Tagliare la congiuntiva lungo il limbus come la dissezione procede per consentire un'ulteriore dissezione.
   2. Rimuovere congiuntiva tutto intorno all'occhio (360 gradi) per esporre il più sclera possibile.
      NOTA: È utile lasciare una piccola quantità di congiuntiva per facilitare fissarsi l'occhio con i perni chirurgici o una pinza durante il resto della procedura.
3. Creare un completo lembo sclerale spessore lungo unolato dell'occhio (bisturi 69).
   1. Fare un ~ 5 millimetri incisione sclerale parallelamente al limbus e 3 mm posteriormente al limbus tagliando delicatamente nella sclera con un bisturi (lama da bisturi 11) fino coroide pigmentazione scura è visibile. Fare attenzione a non incidere coroide stesso.
   2. Sezionare cautela lungo il piano tra la sclera e della coroide, sia con le forbici (utilizzando smussa) o con il bisturi, finché è possibile ampliare lo spazio potenziale tra questi tessuti spingendo coroide leggermente verso l'interno.
   3. Effettuare un'altra incisione sclerale perpendicolare alla prima incisione sclerale con microscissors taglienti, creando una incisione a forma di T.
   4. Poi continuare a sezionare bruscamente in modo circonferenziale per rimuovere il tessuto sclerale dalla coroide sottostante e spingere delicatamente la coroide dalla sclera come detto sopra.
   5. Ingrandire il lembo sclerale, se necessario.
      1. Delicatamente Blunt sezionare la coroide lontano dalla scleradurante tutto il processo.
      2. Allargare lo sportello finché l'incisione fatta perpendicolarmente al limbus raggiunge il nervo ottico e incisione fatta parallelo al limbus è almeno un terzo della circonferenza dell'occhio (45 °).
      3. Utilizzare il lembo sclerale come fonte di leva per manipolare l'occhio durante la dissezione smussa. Il contro-trazione sul lembo facilita scollamento.
   6. Ripetere il passaggio precedente sull'altro lembo sclerale.
4. Tagliare i lembi sclerali per esporre una vasta area della coroide.
5. Continuare l'incisione fatta nel passaggio 3 circonferenza dell'occhio (360 gradi).
6. Rimuovere il restante tessuto coroide-retina.
   1. All'interno della regione esposta, usare un cotton-tip per spazzolare delicatamente il tessuto della coroide-retina rimanente. In alternativa, afferrare delicatamente il tessuto con una pinza e sbucciare fuori dal corpo vitreo sottostante.
   2. Se necessario fare un'incisione nella coroide stArting dal nervo ottico. Poi staccarsi coroide delicatamente per esporre la retina e la corteccia vitreo.
7. Continuare smussato sezionare la coroide dalla sclera e poi staccarsi coroide per ottenere il tutto, vitrea intatto.
8. Utilizzare il cerchio sclerale attaccato alla cornea per posizionare l'intero vetrosa in posizione desiderata. A questo punto, il vitreo è collegato alla sclera anteriore e lente.
9. Blunt sezionare il vitreo dall'interno della sclera, intorno alla lente, eliminando tutti sclera.
10. Utilizzare uno strumento smussato per raccogliere la lente dal vitreo se necessario. Utilizzare il campione per vari esperimenti vitreodynamic.
    1. Mettere campione in un bicchiere di vetro con nota superficie esposta all'aria. Inserire sonda sensibile all'ossigeno al bordo del campione. Utilizzare un micromanipolatore per spostare la sonda ad una distanza nota (r) nel campione.
    2. Utilizzare Leggi di Fick per ottenere l'equazione di diffusione teorica. Con il data raccolta in fase di 10.1, ottenere il termine coefficiente di diffusione sperimentale / reazione etc.

Risultati

Seguendo il protocollo porterà ad una dissezione vetrosa di successo con il nucleo e la corteccia (figura 3) intatto. Questo è evidente dai pezzi residui di retina aderito alla corteccia vitreo. Intatto intera vitreo può essere utilizzato in diversi modi per specifici esperimenti vitreodynamic. Nel nostro caso, il tasso di diffusione di ossigeno intatta vitreo ed è costante di tempo corrispondente è stato studiato (Figura 2). Vetroso che è stato dissezionato (nucleo e la corteccia...

Discussione

Ci sono due passaggi critici che devono essere accuratamente eseguite durante la dissezione vitreo. Fase 3, la creazione di un completo lembo sclerale spessore, è fondamentale per l'intero dissezione. Si deve prestare attenzione a non tagliare in coroide quando si crea il pieno spessore lembo sclerale. L'altro passaggio fondamentale è sezionando via la sclera dalla coroide. Questo passaggio deve essere fatto con attenzione per evitare la creazione di più fori nella coroide da cui vitreo può fuoriuscire. C...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 forceps	Storz Opthalmics	E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right	Storz Opthalmics	E3320 R
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle	VWR	470174-844