Whole humor vítreo Dissecção de Análise Vitreodynamic

Resumo

The goal of this protocol is to show an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes.

Resumo

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous studies have shown the results of such dissections, the detailed steps have not been described, precluding researchers outside the field from replicating their methods. Other studies harvest vitreous either through aspiration, which does not maintain the vitreous structure anatomy, or through partial dissection, which only isolates the vitreous core. The proposed method isolates the whole vitreous body, with the vitreous core and cortex intact, while maintaining vitreous anatomy and structural integrity. In this method, a full thickness scleral flap in an enucleated porcine eye is first created and through this, the choroid tissue can be separated from the sclera. The scleral flap is then expanded and the choroid is completely separated from the sclera. Finally the choroid-retina tissue is peeled off the vitreous to leave an isolated intact vitreous body. The proposed vitreous dissection technique can be used to study physical properties of the vitreous humor. In particular, this method has significance for experimental studies involving drug delivery, vitreo-retinal oxygen transport, and intraocular convection.

Introdução

O objectivo deste método é a de detalhe uma técnica para isolar todo um corpo vítreo, intacta, com o núcleo vítreo e córtex intacto, a partir de um olho de cadáver, para efeitos de análise vitreodynamic. Como o campo da fisiologia vítreo tem crescido, pesquisadores multidisciplinares, tais como mecânica dos fluidos pesquisadores, estão a investigar as propriedades físicas e biomecânicas do vítreo ^1. Para este fim, é essencial detalhe uma técnica para isolar todo o, corpo vítreo intacta para ajudar os investigadores multidisciplinares.

Sebag et al. ² e ³ outros realizados inteiras elegantes dissecações de cadáveres vítreas em olhos humanos e mostrou ilustrações dos resultados. No entanto, a técnica utilizada não foi descrito em pormenor e não especialistas não seria capaz de se replicar independentemente do método. Outros estudos têm colhido vítreo de cadáveres olhos usando métodos mais simples, como aspiração ou dissecação parcial,ambas as quais não resultam em conjunto um corpo vítreo, intacta. Gisladottis et al. ⁴ e Xu et al. ⁵ investigar permeabilidade no humor vítreo colhida a partir de olhos de cadáveres. No entanto, uma vez que nenhum método de extracção vítreo foi descrito, assumiu-se que eles aspirado do humor vítreo com uma seringa. Watts et al. ⁶ foi um passo adiante, descrevendo um método de isolamento de coelho humor vítreo com uma técnica cirúrgica. No entanto, este método resulta num isolamento de apenas o núcleo vítreo e não no córtex vítreo. Skeie et al. ⁷ posteriormente organizou o vítreo em 4 regiões únicas e elegantemente descrito um método para dissecar cada parte para análise. Esta técnica no entanto, não resultar numa vítreo intacto como um todo.

A técnica actual foi desenvolvido para facilitar experiências biofísicas que actualmente apenas são realizadas em cadáveres olhos. Os métodos anteriores, como descrito umbove, são limitados porque 1) nenhuma isolar completamente todo o corpo vítreo, núcleo e córtex vítreo 2) colhidas são homogeneizados, 3) estrutura anatômica vítreo não é mantido, ou 4) técnicas de dissecação não são adequadamente detalhados para a replicação por pesquisadores em outros campos . Além disso, devido à opacidade da esclera e coróide, visualização do corpo vítreo é limitado no globo ocular intacto. Isto limita a precisão das medições de viabilidade e que podem ser feitas dentro de todo o olho. Além disso, as estruturas anatómicas circundantes do vítreo pode confundir o estudo das propriedades bioquímicas e físicas do vítreo.

Nos últimos anos, o corpo vítreo da ciência tem crescido muito e não há razão para acreditar que todo o corpo vítreo tem propriedades diferentes do que suas partes individuais. Há um crescente interesse em investigar as propriedades físicas, biomecânicos e químicas do vítreo para vitreodynamics research, que tem aplicações na medicina clínica, tais como a entrega de drogas, oxigenação intravítrea ⁸ e vitrectomia. Vitreodynamics farmacológicos, que utiliza agentes farmacológicos para manipular o vítreo, pode ser utilizada para melhorar os resultados de vitrectomia ^9. As propriedades biomecânicas são utilizados para modelar o fluxo de fluido vítreo, que pode ser usado para melhorar as tecnologias de entrega de drogas intravítrea ^10-12. Propriedades físicas de vários segmentos da vítreo são cruciais para a compreensão de transporte de oxigênio vítreo-retiniana ^13. A técnica de dissecção do vítreo proposto pode ser utilizado para estudar diversas propriedades do humor vítreo intacta. Ele permite que os experimentos de bancada a ser feito em, corpos vítreos intactas inteiros com melhor visualização.

Em resumo, os métodos actuais para o estudo do vítreo ou não são adequadamente descritos, ou resultar em um isolamento completo do núcleo vítreo e no córtex. Portanto, existe uma necessidade de executar experiments em um modelo de olho transparente, mantendo a anatomia do vítreo existente no olho cadáver.

Protocolo

Todos os olhos enucleados foram obtidos a partir de um matadouro e todos os experimentos foram realizados de acordo com as leis de biossegurança institucionais.

1. Fixe olho enucleado para baixo em uma superfície. Fazer isso colocando os pinos do tecido através do excesso de tecido em torno do olho e prendendo-o para baixo em uma placa de isopor.
2. Dissecar e retire conjuntiva perilimbal de olho.
   1. Use uma pinça fina (0,3 fórceps) e microtesoura (tesoura Westcott) para inciso conjuntiva no limbo e sem rodeios dissecá-lo fora da esclera. Cortar a conjuntiva ao longo do limbo como a dissecção romba prossegue para permitir posterior dissecação.
   2. Remover conjuntiva a toda a volta do olho (360 graus) para expor tanto quanto possível esclera.
      NOTA: É útil para deixar uma pequena quantidade de conjuntiva para facilitar a fixação do olho com os pinos de uma pinça cirúrgica ou durante o resto do procedimento.
3. Criar um retalho escleral de espessura total ao longo de umlado do olho (lâmina de bisturi 69).
   1. Adicione uma ~ 5 milímetros incisão escleral paralela ao limbo e 3 mm posterior ao limbo cortando suavemente para dentro da esclerótica com um bisturi (lâmina de bisturi 11) até coróide pigmentadas é visível. Tenha cuidado para não inciso a própria coróide.
   2. Cuidadosamente dissecar ao longo do plano entre a esclera e coróide, ou com tesouras (utilizando uma dissecção romba) ou com o bisturi, até que seja possível aumentar o espaço de potencial entre estes tecidos, empurrando suavemente para dentro da coróide.
   3. Fazer uma outra incisão escleral perpendicular à primeira incisão escleral com microtesouras afiadas, criando uma incisão em forma de T.
   4. Em seguida, continuar a dissecar bruscamente de um modo circunferencial para remover o tecido a partir da coróide esclerótica subjacente e empurre o coróide longe da esclera como mencionado acima.
   5. Ampliar a retalho escleral, conforme necessário.
      1. Suavemente sem corte dissecar a coróide longe da escleradurante todo o processo.
      2. Aumentar a aba até que a incisão feita perpendicularmente ao limbo atinge o nervo óptico e a incisão feita paralela ao limbo é, pelo menos, um terço da circunferência do olho (45 °).
      3. Use a retalho escleral como fonte de alavancagem para manipular o olho durante a dissecção romba. O contra-tração na aba torna mais fácil para dissecção romba.
   6. Repita o passo anterior no outro retalho escleral.
4. Cortaram os retalhos esclerais para expor uma grande área de coróide.
5. Continuar a incisão feita no passo 3 em torno da circunferência do olho (360 graus).
6. Remover o tecido coróide-restante retina.
   1. Dentro da região exposta, use um algodão-ponta para escovar suavemente o tecido coróide-retina restante. Alternativamente, agarram delicadamente o tecido com uma pinça e retire-a do corpo vítreo subjacente.
   2. Se for necessário fazer uma incisão na coróide starting do nervo óptico. Em seguida, retire a coróide suavemente para expor a retina eo córtex vítreo.
7. Continuar sem corte dissecar a coróide longe da esclera e, em seguida, retire a coróide obter todo o vítreo intacta.
8. Utilizar o aro escleral fixada na córnea para posicionar todo o vítreo em local desejado. Neste ponto, o vítreo é ligada à esclerótica anterior e lente.
9. Blunt dissecar o vítreo a partir do interior da esclerótica, à volta da lente, a remoção de todos esclera.
10. Use uma ferramenta sem corte para colher a lente de distância do vítreo se for necessário. Use o exemplo para várias experiências vitreodynamic.
    1. Colocar a amostra num copo de vidro com uma área superficial conhecida exposta ao ar. Coloque sonda sensível ao oxigénio no bordo da amostra. Usar um micro-manipulador para mover a sonda para uma distância conhecida (R) na amostra.
    2. Use Lei de Fick para obter a equação de difusão teórico. Com a data recolhidas no passo 10.1, obtenha o termo coeficiente de difusão experimental / reação etc.

Resultados

Seguindo o protocolo irá levar a uma dissecção do vítreo bem sucedida com o núcleo e o córtex (Figura 3) intactos. Isto é evidente a partir dos pedaços residuais de retina aderiram ao córtex vítreo. Todo intacta humor vítreo pode ser usado de várias maneiras para experiências vitreodynamic específicos. No nosso caso, a taxa de difusão do oxigénio no humor vítreo intacto e é constante de tempo correspondente foi estudada (Figura 2). Vítreo que foi dissecado (núcleo e ...

Discussão

Existem dois passos críticos que devem ser cuidadosamente realizados durante a dissecção vítreo. Passo 3, a criação de uma aba escleral de espessura total, é crucial para toda a dissecção. Cuidados devem ser tomados para não cortar na coróide ao criar a espessura total retalho escleral. O outro passo crítico é dissecar afastado da esclera da coróide. Esta etapa deve ser feito com cuidado para evitar a criação de vários buracos na coróide de que o vítreo pode derramar. Existe uma maneira de modificar o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 forceps	Storz Opthalmics	E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right	Storz Opthalmics	E3320 R
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle	VWR	470174-844