Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em&gt; Nematostella vectensis</em

Zusammenfassung

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Zusammenfassung

Die Nesseltiere und insbesondere Hydra, waren die ersten Tiere gezeigt beschädigt oder durchtrennt Strukturen zu regenerieren, und zwar solche Studien wohl moderne biologische Untersuchung durch die Arbeit von Trembley vor mehr als 250 Jahren. Sowohl mit "klassischen" regenerative Organismen, wie die Hydra, planaria und Urodelen sowie eine Verbreiterung Artenspektrum die den Bereich von Metazoen aus Schwämmen durch Säugetiere Derzeit Studium der Regeneration hat ein Wiederaufleben gesehen. Neben dem Eigeninteresse als ein biologisches Phänomen, das Verständnis, wie die Regeneration in einer Vielzahl von Arten Werke werden uns darüber informieren, ob regenerative Prozesse teilen gemeinsame Merkmale und / oder Arten oder kontextspezifischen zellulären und molekularen Mechanismen. Das Starlet Seeanemone, Nematostella vectensis, ist ein aufstrebender Modellorganismus für die Regeneration. Wie Hydra ist Nematostella ein Mitglied der alten Stamm, Nesseltiere, aber innerhalb von ter Klasse anthozoa, eine Schwester Clade zum hydrozoa, die evolutionär basaleren ist. So Aspekte der Regeneration in Nematostella wird interessant sein , mit denen der Hydra und anderen Nesseltieren zu vergleichen und gegenüberzustellen . In diesem Artikel stellen wir eine Methode zu halbieren, zu beobachten und die Regeneration des aboral Ende des Nematostella Erwachsenen zu klassifizieren, die die Physa genannt wird. Die Physa erfährt natürlich Spaltung als Mittel zur ungeschlechtlichen Fortpflanzung, und entweder natürliche Spaltung oder manuelle Amputation des Physa löst erneute Wachstum und Rückbildung von komplexen Morphologien. Hier haben wir diese einfachen morphologischen Veränderungen in einem Nematostella Regeneration Staging - System (die NRSS) kodifiziert. Wir verwenden die NRSS die Wirkung von Chloroquin zu testen, einen Inhibitor der lysosomalen Funktion blockiert Autophagie. Die Ergebnisse zeigen, dass die Regeneration von Polyp Strukturen, insbesondere der Mesenterien, abnormal ist, wenn autophagy gehemmt wird.

Einleitung

Die Beobachtung der Regeneration in einem einzigen hydra war das wegweisendes Ereignis in dem Aufkommen der Biologie als experimentelle Wissenschaft ^1,2. Regeneration bleibt ein Phänomen der außerordentlich breiten Appell an Biologe und Laien gleichermaßen. Das Potenzial für die Entwicklungsbiologen, Kliniker, biomedizinische Wissenschaftler und Gewebe - Ingenieure zu verstehen und die Grenzen für die menschliche Regeneration überwinden macht mehr Regenerationsbiologie als eigen interessant.

Jetzt, mit dem Einsatz neuer Technologien wie der Genomsequenzierung und Gewinn und Verlust der Funktion Tools, wird das Feld balanciert auseinander regenerative Mechanismen zu necken und um schließlich zu verstehen, wie verschiedene Arten regenerieren kann, während andere nicht können. Der Grad der Gemeinsamkeit in der molekularen, zellulären und morphologischen Reaktionen ist noch nicht geklärt werden, aber bisher scheint es, dass die grundlegenden Reaktionen bei den Tieren, die mehr ähnlich regenerieren kann, ist als gewesen imagi hättened nur vor einem Jahrzehnt ^3.

Die Nesseltiere sind vor allem leicht auf fast alle ihre Körperteile unter einem breiten Spektrum von morphologischen Vielfalt zu regenerieren. Aus dem einsamen Süßwasserpolypen, Hydra zusammen mit den winzigen Meeres Polypen, die immense Korallenriffe, auf die komplexen Kolonial Siphonophoren, wie der portugiesischen Man-O-War bauen, Regeneration ist oft eine Art der Fortpflanzung, zusätzlich zu einem Mechanismus für Reparatur oder beschädigte oder verlorene Körperteile Reformierung von Verletzungen und predation führt. Ob die verschiedenen Arten von Cnidaria verwenden ähnliche oder andere Mechanismen für die Regeneration ist eine grundsätzlich interessante Frage ^4-6.

Wir und andere haben die anthozoan entwickelt, vectensis Nematostella als Modell für die Regeneration ^17.07. Wir entwickelten kürzlich ein Staging-System zur Beschreibung Regeneration eines gesamten Körpers von einem morphologisch einheitlichen Stück Gewebe aus dem Abora halbiertenl Ende der Polyp ^10. Während Nematostella Polypen regenerieren kann , wenn auf jeder Ebene halbierten, haben wir uns für Erwachsene in einer aboral Position in der die meisten morphologisch einfachen Region, die Physa, teilweise zu schneiden , da dies zu der normalen Ebene der natürlichen asexuelle Spaltung ¹⁸ in der Nähe ist, und weil es auch erlaubt die Beobachtung und molekulare Analysen, wie ein ganzer Körper von den einfachsten morphologischen Komponenten wieder zusammengebaut.

Die Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) bietet eine relativ einfache Reihe von morphologischen Benchmarks , die verwendet werden könnten , um den Fortschritt von jedem Aspekt der Regeneration von einem amputierten Physa unter normalen Kulturbedingungen zu punkten oder gestört experimentell Situationen wie kleine Molekül - Behandlungen, genetische Manipulation oder Umwelt Veränderung. Wie erwartet, wird immer die NRSS als morphologische Gerüst angenommen, auf dem die zellulären und molekularen Vorgänge der Regeneration verwiesen werden kann10.

Endlich ist unser Verfahren des Schneidens erzeugt ein klaffendes Loch mehrere Größenordnungen größer ist als die Einstichstift Punkt in einer aktuellen Studie verwendeten ^17, doch sind beide Wunden heilen in etwa 6 Stunden. Dokumentieren der visuell Arretieren und verschiedene Phasen des Wundverschlusses sollten experimentelle Ansätze schlagen die scheinbare Unabhängigkeit der Größe einer Wunde und der Zeit, um es zu schließen nimmt zu erklären. So kann ein tieferes visuelles Verständnis des aboral Amputation Prozess, durch dieses Protokoll zur Verfügung gestellt wird, unterstützen weitere Untersuchungen in diesem Regenerationssystem Modell und erweitern die Anwendung dieses Staging - System Nematostella vectensis verwenden.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Tiere für Temperatur, Ernährung und Hell / Dunkel-Zyklus

1. Erhalten Nematostella vectensis Erwachsene aus einem der zahlreichen Nematostella Labors weltweit, oder Non-Profit - Anbieter (Tabelle 1)
2. Aufrechterhaltung Nematostella bei konstanter Temperatur (typischerweise zwischen 18 und 21 ° C) im Dunkeln, in "1 / 3x" künstlichem Meerwasser (ASW) in einer Salinität von 12 Teilen pro Tausend (ppt). Pflegen Kulturen in einfachen Kalk-Natron-Glas Kulturschalen, in der Regel 250 ml oder 1,5 l Kapazität ^11.
   Hinweis: Diese einfachen Kulturbedingungen werden häufig unter Labors verwendet , die Nematostella studieren, aber Kultur Pflege kann auch ¹⁹ automatisiert werden.
3. Feed - Nematostella frisch geschlüpften Artemianauplien 2 - 4x pro Woche. Hatch Artemia Zysten in voller Stärke (36 ppt) oder 1 / 3x ASW bei 30 ° C, in einem flachen rechteckigen Glasschale ²⁰ oder ineine beliebige Anzahl von kleinen, kommerzielle oder hausgemachte Artemia Brütereien. Wenn ein Inkubator nicht verfügbar ist, Garnelen wird bei RT schlüpfen aber nicht so langsam mehr.
   Hinweis: Dies erfordert oft mehr als 24 Stunden für die Fertigstellung.
4. Ersetzen Anemone Kultur Wasser mindestens einmal pro Woche. Für beste Erwachsene Gesundheit, gründlich zu reinigen (ohne Seife) Schüsseln die Kultur einmal pro Woche von angesammeltem Schleimabsonderungen, die die Schüssel Mantel und kann Falle Futterreste und Abfall, und die Tiere verstricken.

2. Auswahl und Entspannung der Ernährungsphysiologisch Anlage Tiere

1. Wählen Sie Größe abgestimmte Polypen von etwa der gleichen Länge (3 - 5 cm, wenn natürlich entspannt) und legen Sie sie in eine Schüssel aus der Kolonie getrennt für drei Tage vor der Amputation.
   Hinweis: Die Anzahl der Tiere zum Schneiden ausgewählt wird durch das Experiment bestimmt werden wird durchgeführt, natürlich, aber im Allgemeinen empfehlen wir mindestens fünf Tiere pro Probenpunkt mit sechs Replikationen. So,in einem typischen Versuch würde ein Minimum von 30 Tieren vorgewählt werden. Im Allgemeinen ist es ratsam, mehr als die Mindestzahl (30) seit Amputationen zu wählen, die unregelmäßig sind (siehe unten) können Scoring später auswirken.
2. Entfernen Sie die Schale von ausgewählten Tieren aus dem Inkubator in Raumlicht mindestens eine Stunde vor der Amputation.
   Hinweis: Die Exposition gegenüber Raumlicht und Schwingungen der Handhabung wird wahrscheinlich die Tiere verursachen schrumpfen, also müssen sie durch Inkubation auf dem Labortisch angepasst oder "entspannt" werden. Die Tiere werden sich Feuerfest- und Lichtexposition zu berühren und an diesem Punkt kann durch vorsichtiges Pipettieren bewegt werden.
3. Optional: Anesthetize die Tiere um 7,5% MgCl ₂ Zugabe (in 1 / 3x ASW). Sanft fügen Sie die MgCl ₂ - Lösung mit einem Standard - Kunststoff - 5 - ml - Pipette in die Schüssel.
   Hinweis: Obwohl Tiere schließlich gewöhnt, wird dem Licht und physikalische Manipulation kann es vorteilhaft sein, Tiere zu betäuben zu erhalten oder zu "reparieren" ter entspannte Zustand , nachdem sie länglichen ^16,21,22 geworden sind.
4. Verwenden Sie eine große Bohrung (> 0,5 cm) Plastikpipette zu übertragen (in 1 / 3x ASW) fünf Tiere aus dem Pool amputiert werden, in den Boden einer sterilen Glasschneideschale von 100 mm Durchmesser mit 12 ppt ASW. Die Schale auf die Bühne eines Stereomikroskops mit variabler Vergrößerung zwischen 10 - 40X.
   Hinweis: Wurden die Tiere nicht betäubt worden und entspannt zum Schneiden, können sie immer noch zu berühren und Stereoskop Beleuchtung reagieren und damit ein paar Minuten brauchen kann wieder entspannt zu werden.

3. Amputation

1. Mit einem sterilen Skalpell, amputiert die aboral Physa von jeder Polyp, mit dem Ziel, einen Abschnitt des Physa zu erhalten, die etwa so lang ist wie breit und kein Mesenterium enthielt.
   Hinweis: Die ideale Schnittbaustelle zur Beendigung des Mesenteriums nur aboral ist. Auf der Ebene des Schneidens gibt es einen Übergang von Gekröse eigentlichen dünnen lines zu jeder mesenteriales Einfügung entsprechenden (siehe Abbildung 1, Pfeile). Das Fehlen von Gekröse ist kritisch , weil es produziert Schleim, der "Verstopfung" das Loch ^17,30 erleichtern kann.
   1. Platzieren Sie die Skalpellklinge in Kontakt mit dem Tier an der gewünschten Stelle der Amputation. Tun Sie dies entweder ohne fremde Hilfe (freihändig) oder durch sanft den Körper des Tieres mit einem # 5 Zange (Dumont Stil oder ähnliches) zu erfassen.
   2. Schneiden durch das Gewebe durch die gebogene Klinge des Skalpells Nutzung in einem Rucken Bewegung über den Körper.
      Hinweis: Das Gewebe sollte sauber durchtrennen, wie das Skalpell geschwenkt wird und befreien den Abschnitt von Physa vom Spender gewünscht. Wenn jedoch ein kleines Stück Gewebe noch den Körper und den Physa verbindet, schneiden Sie es mit dem Skalpell. Versuchen Sie nicht, durch Ziehen der verbundenen Stücke trennen, da dies den Physa beschädigen können.
2. Entfernen Sie jede amputierte "Spender" Polyp aus der Schale und senden es an einem sepaRate Schüssel "gepoolt Amputierte" markiert; datieren die Schüssel und senden es an Stammkultur.
   Hinweis: Amputierte Polypen wird die aboral Wunde innerhalb eines Tages heilen und dann normal gefüttert werden kann. Sie werden eine normal aussehende Physa innerhalb von zwei Wochen, an welcher Stelle regenerieren die Physa wieder amputiert werden kann, falls gewünscht.
3. Spülen Sie das exzidiert Physa, die in 12 ppt ASW in der Schneidschale verbleiben, dann Transfer jedes Physa in eine separate sterile auch in einem Multi-Well-Zellkulturplatte, die bereits 10 ml 12 ppt ASW hat in jeder Vertiefung.
   Hinweis: Dieses Beispiel eine sechs-Well-Platte verwendet, mit jedem gut hält 10 ml Meerwasser und fünf excised Physa. Im allgemeinen Meerwasser sollte die Physa decken ausreichend Kontakt mit Luft zu vermeiden, aufgrund der Bewegung in der Handhabung und potentielle Verdunstung. Die Platte oder Brunnen sollte einen Deckel haben.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,3 für jede experimentelle Behandlung mindestens 5 Physa in jeder Vertiefung zurückhaltender zu sammeln.
5. Inkubieren Sie die Physa bei einer Temperatur, die prov wirdide den günstigsten Preis der Regeneration für die geplanten experimentellen Verhöre. Die Platte, die Physa in einen temperaturgeregelten Inkubator enthält, bei einer festen Temperatur von der gewünschten Rate der Regeneration bestimmt.
   Hinweis: Die Physa regenerieren Gewebe und bilden eine vollständige Polyp fehlen, wenn zwischen 15 und 27 ° C bei Temperaturen inkubiert. Die Regenerationsrate temperaturabhängig ist mit Ausnahme der ersten beiden Stufen. Die durchschnittliche Tag für das Erreichen Stufe 4 für alle Temperaturen 7 d nach dem Schneiden und dies deckt sich auch mit der Regeneration bei 21 ° C. Bei 27 ° C, Stufe 4 wird etwa 3 Tage früher erreicht und bei 15 ° C, Stufe 4 wird von etwa 3 d im Vergleich zu Regeneration bei 21 ° C (siehe auch Referenz 10) verzögert.

4. Bewertung Regeneration mit dem Nematostella Regeneration Staging System (NRSS)

1. Ergebnis der Physa mit einem Stereomikroskop Verbindung mit variabler magnification (10 - 80X). Ergebnis der frisch geschnittenen Nematostella Physa als Stufe 0 und weiter Scoring zur gleichen Zeit jeden Tag nach der Amputation (dpa) mit dem NRSS ^10.
   Hinweis: Für die Schlüssel Inszenierung Kriterien und Details siehe Referenz 10.
   1. Score Physa als Stufe 0 (offene Wunde), wenn ein frisch geschnittenem Physa erscheint als schalenförmige Masse einen schlaffen Ballon ähnelt, mit einer offenen Wunde ist wahrscheinlich sichtbar.
      Hinweis: Die Wundränder können auch zusammenhalten von Anfang an, aber das Gewebe wird noch zusammengeklappt werden, und es fehlt ihnen Steifigkeit. Die Ränder der offenen Wunde kann eine radiale Kontraktion als die Wunde heilt beobachtet werden, unterziehen.
   2. Score Physa als Stufe 1 (Wunde geschlossen), wenn die Amputation Wunde geschlossen erscheint.
      Hinweis: Wund Standort für die Zukunft oralen Pol entsprechen. Die Außenfläche rund um die Zukunft oralen Pol beginnen kann entsprechend den zugrunde liegenden radial symmetrischen endodermaler mesenteriales Einfügungen unterschiedliche Bögen anzuzeigen.
   3. Score physa als Stufe 2 (radiale Bögen), wenn die Oberfläche der Mund pole aufgeblasen erscheint, acht erhöht Bögen in einem radialsymmetrischen Muster angeordnet sind offenbart und durch Rillen getrennt sind. Beobachten kleine, halbkugelige blebs an der Spitze der Bögen. Sie werden in etwa so hoch wie breit, wahrscheinlich vorübergehend sein und zunächst durch eine einzige ektodermale Zellschicht besteht.
      Hinweis: In einigen Fällen doppelschichtigen blebs stabilisieren kann. Hinweis: Bei dieser oder späteren Stadien eine Schleimschicht erscheinen die Physa (Abbildung 2) in einer membranartigen 'Mantel' zu verkapseln. Das Verkapselungsmaterial sollte Scoring zu erleichtern entfernt werden.
   4. Score Physa als Stufe 3 (Tentakel), wenn die Knospen der Tentakeln enthält endodermaler und ektodermalen Gewebeschichten sind stabil in der mündlichen Ende wenigstens einigen radialen Bögen gebildet.
      Hinweis: Die Fühler sind länger als breit sind und sind minimal beweglich. Die Physa wird zeigen, erhöht, aber variable Inflation, so dass Gekröse Rudimente kann vis werdenIVK vom mesenterialen Einführen in die Körperhöhle erstreckt (coelenteron).
   5. Score Physa als Stufe 4 (Linear Mesenterien), wenn die Physa enthält acht verschiedene, sichtbare Gekröse, die in die coelenteron von Einfügungen in der Körperwand erstrecken, mit oral-aboralen Längen, die mehr als das Doppelte ihrer radialen Breite sind gemessen, von wo sie erscheinen zu verbinden zu den Rachen an seinem aboral Ende (enterostome).
      Hinweis: vier oder weniger Gekröse "gefaltete" interne freie Kanten aufweisen. Der Rachen ist sichtbar. Mehr als acht Tentakeln sichtbar sind, beweglich und manchmal in den Körper sie schrumpfen.
   6. Score Physa als Stufe 5 (vorwiegend Plissee Mesenterien), wenn die Physa mehr als vier Gekröse mit Plissee hat, und das Plissee ist voll und gewundenen als in Stufe 4. Das Tier eine fast "normalen" Erwachsenen Aussehen hat, aber es gibt keine sichtbaren Gonadenzellen.

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Ergebnisse

Der Verlauf der morphologischen Ereignisse während der Regeneration in abgeschlagene Physa ist in 1A gezeigt , die an jedem NRSS Stufe repräsentative Ansichten von Physa umfasst. Der typische Physa Schnitt Seite ist auf den Erwachsenen (Pfeilspitzen) angegeben. Die Fotografien in 1A zeigen progressive Regeneration von Mund- und Körperstrukturen von frisch geschnittenem Physa durch voll ausgebildete Polyp. 1B, C , die die Anordnung der...

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Diskussion

Die Verwendung von Nematostella als Modell der Wundheilung und Regeneration wird immer beliebter. Somit ist es wichtig, die morphologische Muster eines bestimmten Protokolls vor dem wirksamen zellulären und molekularen Analysen zu können, können zur Visualisierung zugeordnet und verglichen werden. Nematostella haben ein hohes Maß an regenerativen "Flexibilität", fast jedes fehlende Struktur an jeder Stelle amputiert zu reformieren , in der Lage, bei post-Planula Phasen des Lebens. So hab...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL	Carolina Biological Supply	741004	250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL	Carolina Biological Supply	741006	1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 - 40X magnification