Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Resumo

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Resumo

Cnidários e, especificamente, Hydra, foram os primeiros animais indicado para regenerar estruturas danificadas ou cortada, e na verdade esses estudos sem dúvida lançados investigação biológica moderna através do trabalho de Trembley mais de 250 anos atrás. Presentemente o estudo de regeneração tenha visto um ressurgimento usando ambos os organismos regenerativos "clássicas", tais como a hidra, e Planaria Urodelos, bem como um alargamento do espectro de espécies que abrangem a gama de metazoários, a partir de esponjas através de mamíferos. Além de seu interesse intrínseco como um fenômeno biológico, a compreensão de como a regeneração funciona em uma variedade de espécies irá informar-nos sobre se a processos regenerativos compartilhar recursos e / ou espécies comuns ou mecanismos celulares e moleculares específicas ao contexto. A anêmona de mar estrela, Nematostella vectensis, é um organismo modelo emergente para a regeneração. Como Hydra, Nematostella é membro do filo antiga, cnidaria, mas dentro de tele anthozoa classe, um clado irmão do Hydrozoa que é evolutivamente mais basal. Assim, os aspectos da regeneração na Nematostella será interessante comparar e contrastar com os de Hydra e outros cnidários. Neste artigo, apresentamos um método para bissetriz, observar e classificar a regeneração do fim aboral do adulto Nematostella, que é chamado de physa. O physa naturalmente sofre fissão como um meio de reprodução assexuada, e quer fissão naturais ou amputação manual da physa desencadeia re-crescimento e reforma de morfologias complexas. Aqui temos codificada estas alterações morfológicas simples em um sistema de estadiamento Nematostella Regeneração (a ENSR). Usamos o NRSS para testar os efeitos de cloroquina, um inibidor da função lisossómica que bloqueia autofagia. Os resultados mostram que a regeneração de estruturas de pólipos, particularmente os mesentério, é anormal quando autofagia é inibida.

Introdução

A observação de regeneração em um único hidra foi o evento seminal na advento da biologia como um ^1,2 ciência experimental. Regeneração continua a ser um fenômeno da extraordinariamente amplo apelo para biólogo e leigo alike. O potencial para os biólogos do desenvolvimento, médicos, cientistas biomédicos e engenheiros de tecido para entender e superar os limites sobre a regeneração humana faz biologia regeneração mais de intrinsecamente interessante.

Agora, com o uso de tecnologias emergentes, como a sequenciação do genoma e ganho e perda de ferramentas de função, o campo está pronta para provocar mecanismos além regenerativos e compreender, finalmente, como espécies diferentes podem se regenerar enquanto outros não podem. O grau de comunalidade nas respostas moleculares, celulares e morfológicas continua a ser elucidado, mas até agora parece que as respostas básicas entre os animais que podem regenerar é mais similar do que teria sido imagiNED há apenas uma década ^3.

Cnidários em particular, são facile na regeneração quase todas as suas partes do corpo em meio a um amplo espectro de diversidade morfológica. A partir do solitário pólipo de água doce, Hidra, juntamente com as pequenas pólipos marinhos que constroem imensos recifes de coral, para os Siphonophores coloniais complexos, tais como o Português Man-O-War, a regeneração é muitas vezes um modo de reprodução, além de um mecanismo de reparar ou reformar partes do corpo danificadas ou perdidas resultantes de lesões e predação. Se as diversas espécies de Cnidaria utilizar mecanismos semelhantes ou diferentes para a regeneração é uma questão fundamentalmente interessante ^4-6.

Nós, e outros têm vindo a desenvolver o anthozoan, Nematostella vectensis como um modelo para a regeneração ^7-17. Recentemente, desenvolveu um sistema de estadiamento para descrever a regeneração de um órgão inteiro a partir de um pedaço morfologicamente uniforme de tecido cortada a partir das aboral final do pólipo ^10. Enquanto pólipos Nematostella pode regenerar quando cortada em qualquer nível, nós escolhemos para cortar adultos em uma posição aboral na região mais morfologicamente simples, o physa, em parte porque este é perto do plano normal da fissão assexual natural, ^18, e também porque licenças de observação e análise molecular de como um corpo inteiro é remontado a partir dos componentes morfológicos mais simples.

A encenação Sistema Nematostella Regeneração (ENSR) fornece um conjunto relativamente simples de pontos de referência morfológicas que poderiam ser usados para marcar o progresso de qualquer aspecto da regeneração por um physa amputada, em condições de cultura normais ou experimentalmente perturbado situações como pequenos tratamentos molécula, a manipulação genética ou alteração ambiental. Como antecipado, a NRSS está sendo adotado como um andaime morfológico em que os eventos celulares e moleculares de regeneração pode ser referenciado10.

Finalmente o nosso método de corte produz uma Gaping buracos várias ordens de magnitude maior do que a punção ponto pinos usado em um estudo recente ^17, mas ambas as feridas cicatrizam em torno de 6 horas. Documentar as fases visualmente distintas de prender e de encerramento de feridas deve sugerir abordagens experimentais para explicar a aparente independência do tamanho de uma ferida e o tempo que leva para a fechar. Assim, uma compreensão visual mais profunda do processo de amputação aboral, fornecida por este protocolo, irá auxiliar investigações ulteriores sobre esta sistema de regeneração de modelo e ampliar a aplicação deste sistema de estadiamento usando Nematostella vectensis.

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Protocolo

1. Condicionado dos Animais para temperatura, Nutrição e ciclo claro / escuro

1. Obter adultos Nematostella vectensis de um dos numerosos laboratórios Nematostella em todo o mundo, ou um fornecedor sem fins lucrativos (Tabela 1)
2. Manter Nematostella a uma temperatura constante (tipicamente entre 18 e 21 ° C) no escuro, em "1 / 3x" mar artificial água (ASW) a uma salinidade de 12 partes por mil (ppt). Manter culturas simples de soda-cal placas de cultura de vidro, tipicamente 250 mL ou 1,5 L de capacidade ^11.
   Nota: Estas condições de cultura simples são comumente usado entre os laboratórios que estudam Nematostella, mas cuidado cultura também pode ser automatizado ^19.
3. Alimente Nematostella Artemia recém nascidos náuplios 2 - 4x por semana. Escotilha Artemia cistos em força total (36 ppt) ou 1 / 3x ASW a 30 ° C, em um prato de vidro retangular raso ²⁰ ou emqualquer um de uma série de pequena escala, incubadoras artémia comerciais ou caseiros. Se uma incubadora não está disponível, camarão eclodem na RT, mas fazê-lo de forma mais lenta.
   Nota: Isso muitas vezes requer mais de 24 h para a conclusão.
4. Substituir a água cultura anêmona, pelo menos uma vez por semana. Para uma melhor saúde do adulto, completamente limpa (sem sabão) a cultura tigelas, uma vez por semana de secreções mucosas acumuladas, que o revestimento da bacia e pode armadilha restos de comida e resíduos, e enredar os animais.

2. Seleção e relaxamento dos Animais Nutricionalmente condicionado

1. Seleccione pólipos pareados por tamanho de aproximadamente o mesmo comprimento (3 - 5 cm, quando naturalmente relaxado) e coloque-os em uma tigela separada da colônia durante três dias antes da amputação.
   Nota: O número de animais seleccionados para o corte vai ser determinada pela experiência sendo realizada, é claro, mas, em geral, nós recomendamos pelo menos cinco animais por ponto de amostragem com seis repetições. Assim,Numa experiência típica de um mínimo de 30 animais seria pré-seleccionado. Em geral, é sábio para selecionar mais do que o número mínimo (30), uma vez que são amputações irregular (veja abaixo) podem posteriormente afetar pontuação.
2. Remover o prato de animais seleccionados a partir do incubador em luz ambiente, pelo menos, uma hora antes da amputação.
   Nota: A exposição à luz ambiente e vibrações de manipulação provavelmente fará com que os animais a se contrair, então eles precisam de ser adaptados ou "relaxado" por incubação na bancada do laboratório. Os animais irão tornar-se refractário ao toque e a exposição à luz e em que ponto pode ser movido por pipetagem suave.
3. Opcional: Anestesiar os animais através da adição de 7,5% de MgCl ₂ (em 1 / 3x ASW). Delicadamente adicionar a solução de _MgCl2 para a tigela com um padrão de plástico de 5 mL pipeta.
   Nota: Embora os animais acabará por se tornar habituados à luz e à manipulação física, pode ser vantajoso para anestesiar animais para manter ou "consertar" tele relaxou estado depois que eles se tornaram ^16,21,22 alongado.
4. Utilizar um grande furo (> 0,5 cm) de pipeta de plástico para transferir (em 1 / 3x ASW) cinco animais da piscina para ser amputado, no fundo de uma placa de corte de vidro estéril de 100 mm de diâmetro contendo 12 ppt ASW. Coloque o prato no palco de um microscópio estereoscópico com ampliação variável entre 10 - 40X.
   Nota: Se os animais não foram anestesiadas e relaxado para o corte, eles ainda podem responder ao toque e iluminação estereoscópio e, portanto, pode precisar de alguns minutos para se tornar relaxado novamente.

3. A amputação

1. Usando um bisturi estéril, amputa o physa aboral de cada pólipo, com o objetivo de se obter uma secção da physa que é aproximadamente do mesmo comprimento como é largo e não contendo mesentério.
   Nota: O site corte ideal é apenas aboral à rescisão do mesentério. No plano de corte existe uma transição de mesentério adequada para diluir lines correspondente a cada inserção do mesentério (ver Figura 1, as setas). Ausência de mesentério é crítica porque produz muco que podem facilitar 'ligar' o buraco ^17,30.
   1. Colocar a lâmina de bisturi em contacto com o animal no local desejado de amputação. Fazer isso sem ajuda (mão livre), ou agarrando suavemente o corpo do animal com um # 5 fórceps (estilo Dumont ou similar).
   2. Cortar o tecido, aproveitando a lâmina curva do bisturi em um movimento de "balanço" em todo o corpo.
      Nota: O tecido deve cortar limpa quanto o bisturi é abalada e libertar a seção desejada da physa do doador. No entanto, se um pequeno pedaço de tecido ainda liga o corpo e o physa, cortá-lo com o bisturi. Não tente separar as peças conectadas puxando, pois isso pode danificar o physa.
2. Remover cada pólipo amputada 'doador' do prato e devolvê-lo a um sepabowl taxa rotulados 'amputados comuns »; datar a tigela e devolvê-lo à cultura estoque.
   Nota: pólipos amputados irá curar a ferida aboral dentro de um dia e em seguida, podem ser alimentados normalmente. Eles vão regenerar uma physa aparência normal dentro de duas semanas em que ponto o physa pode ser amputados novamente se desejar.
3. Lavar o physa excisado que permanecem no prato de corte de 12 ppt ASW, em seguida, transferir cada physa a um poço separado estéril numa placa de cultura de células multi-poços que já tem 10 mL de 12 ppt ASW em cada poço.
   Nota: Este exemplo usa uma placa de seis, com cada poço de detenção de 10 ml de água do mar e cinco physa excisada. Na água do mar em geral devem cobrir o physa suficiente para evitar a exposição ao ar devido ao movimento na manipulação e evaporação potencial. A placa de poços ou deve ter uma tampa.
4. Repita os passos de 3,1-3,3 para recolher, pelo menos, 5 physa em cada poço reservado para cada tratamento experimental.
5. Incubar a physa a uma temperatura que vai provide a melhor taxa de regeneração para os interrogatórios experimentais planejadas. Colocar a placa contendo o physa em uma incubadora de temperatura regulada, a uma temperatura fixa, determinada pela desejada taxa de regeneração.
   Nota: O physa irá regenerar tecidos em falta e formar um pólipo completa quando incubados a temperaturas entre 15 e 27 ° C. A taxa de regeneração é dependente da temperatura, excepto para as primeiras duas fases. O dia médio para atingir Fase 4 para todas as temperaturas é 7 d após o corte e isso também coincide com a regeneração a 21 ° C. A 27 ° C, Fase 4 é atingido cerca de 3 dias mais cedo e a 15 ° C, Fase 4 é retardada por cerca de 3 d em comparação com a regeneração a 21 ° C (ver também referência 10).

4. Avaliação de regeneração com o sistema de estadiamento Nematostella Regeneração (ENSR)

1. Marcar o physa usando um microscópio estéreo de composto com magnific variávelção (10 - 80X). Marcar o physa Nematostella recém-cortada como estágio 0 e continuar marcando, ao mesmo tempo, cada amputação dia pós (dpa) usando a ENSR ^10.
   Nota: Para os critérios de paragem-chave e detalhes, consulte Referência 10.
   1. Pontuação physa como Estágio 0 (ferida aberta) se um physa recém-cortada aparece como uma massa em forma Cup- semelhante a um balão flácido, com um local de ferida aberta é provável visível.
      Nota: As bordas da ferida também pode ficar juntos desde o início, mas o tecido ainda vai ser recolhido e falta de rigidez. As bordas da ferida aberta pode ser observado a sofrer contracção radial, a ferida cicatriza.
   2. Pontuação physa como Fase 1 (ferida fechada) se a ferida da amputação parece fechada.
      Nota: local da ferida irá corresponder ao futuro pólo oral. A superfície exterior em torno do futuro pólo oral podem começar a exibir arcos distintos correspondentes aos subjacentes endodérmicas radialmente simétrica inserções mesentéricos.
   3. ph pontuaçãoysa como Fase 2 (radial dos arcos) se a superfície do pólo oral parece inflado, revelando oito arcos dispostos em relevo um padrão radialmente simétrico e separados por ranhuras. Observar pequenas bolhas, hemisféricas no vértice dos arcos. Eles serão tão alto quanto ampla transitória, provável, e, inicialmente composta por uma camada de células ectodérmica única.
      Nota: Em alguns casos bolhas duas camadas pode estabilizar. Nota: Neste ou mais tarde encena uma camada de muco podem aparecer para encapsular o physa (Figura 2) em uma "bainha" membranoso. Este material de encapsulação deve ser removido para facilitar a pontuação.
   4. Pontuação physa como Stage 3 (Tentáculo), se as papilas dos tentáculos contendo endoderme e ectodérmicas camadas de tecido são formadas de forma estável no final oral de pelo menos alguns arcos radiais.
      Nota: Os tentáculos são mais longos do que eles são largas e são minimamente móveis. O physa vai mostram aumento, mas a inflação variável para que rudimentos mesentério pode tornar-se visvel que se prolonga a partir da inserção do mesentério na cavidade do corpo (coelenteron).
   5. Pontuação physa como Fase 4 (mesentérios linear) se o physa contém oito distintos, mesentérios visíveis que se estendem para o coelenteron de inserções na parede do corpo, com comprimentos orais-aboral que são mais do que duas vezes a sua largura radial medida a partir de onde eles parecem ligar para a faringe, na sua extremidade aboral (enterostome).
      Nota: Quatro ou menos mesentérios têm bordas livres internos "pregas". A faringe é visível. Mais de oito tentáculos são visíveis, móveis e às vezes eles contrair no corpo.
   6. Pontuação physa como Stage 5 (predominantemente plissadas mesentérios) se o physa tem mais de quatro mesentérios com pregas, eo pregas é mais completo e sinuosa do que no estágio 4. O animal tem uma aparência adulta quase "normal", mas não há nenhum visível células gonadais.

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Resultados

A progressão de eventos morfológicas durante a regeneração em physa cortada é mostrado na Figura 1A, que inclui vistas representativas de physa em cada fase NRSS. O site típico physa corte é indicado no adulto (setas). As fotografias na Figura 1A mostra a regeneração progressiva das estruturas orais e corporais a partir physa recém-cortada através pólipo completamente formado. Figura 1B, C mostram a disposição dos septos in...

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Discussão

Uso de Nematostella como um modelo de cura de feridas e a regeneração está a tornar-se cada vez mais popular. Assim, é importante ser capaz de visualizar os padrões morfológicos de um protocolo em particular antes de análises celulares e moleculares eficazes podem ser atribuídas e comparados. Nematostella têm um elevado grau de "flexibilidade" regenerativa, ser capaz de mudar a quase qualquer estrutura que falta amputado em qualquer local, em fases pós-Planula de vida. Assim, vário...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL	Carolina Biological Supply	741004	250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL	Carolina Biological Supply	741006	1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 - 40X magnification