Induire complète Polyp Régénération du aboral Physa de la mer Anémone Starlet<em&gt; Nematostella vectensis</em

Résumé

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Résumé

Cnidaires, et plus particulièrement Hydra, ont été les premiers animaux présentés pour régénérer des structures endommagées ou coupées, et en fait de telles études sans doute lancé l' enquête biologique moderne à travers le travail de Trembley il y a plus de 250 ans. Actuellement , l'étude de la régénération a vu une résurgence en utilisant les deux organismes régénérateurs "classiques", comme l'hydre, planaria et Urodèles, ainsi qu'un éventail d'espèces couvrant la gamme des métazoaires d'élargissement, des éponges par les mammifères. Outre son intérêt intrinsèque comme un phénomène biologique, de comprendre comment la régénération fonctionne dans une variété d'espèces va nous informer si les processus de régénération ont des caractéristiques et / ou des espèces communes ou des mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques au contexte. La starlette anémone de mer, Nematostella vectensis, est un organisme modèle émergent pour la régénération. Comme Hydra, Nematostella est membre du phylum antique, cnidaires, mais à l' intérieur til anthozoa de classe, un clade jumeau du hydrozoaires qui est évolutivement plus basale. Ainsi , les aspects de la régénération dans Nematostella sera intéressant de comparer et contraster avec ceux d'Hydra et d' autres cnidaires. Dans cet article, nous présentons une méthode pour bisect, observer et classer la régénération de la fin aboral de l'adulte Nematostella, qui est appelé le physa. Le physa subit naturellement la fission comme un moyen de reproduction asexuée, et soit la fission naturelle ou amputation manuelle du physa déclenche re-croissance et la réforme des morphologies complexes. Ici , nous avons codifié ces changements morphologiques simples dans un système de stadification Nematostella Régénération (la NRSS). Nous utilisons la NRSS pour tester les effets de la chloroquine, un inhibiteur de la fonction lysosomale qui bloque autophagy. Les résultats montrent que la régénération des structures polype, en particulier les mésos, est anormal lorsque l'autophagie est inhibée.

Introduction

L'observation de la régénération en une seule hydra a été l'événement séminal dans l'avènement de la biologie comme une science expérimentale ^1,2. La régénération reste un phénomène de extraordinairement large appel au biologiste et laïc semblables. Le potentiel pour les biologistes du développement, des cliniciens, des chercheurs en sciences biomédicales et des ingénieurs de tissus pour comprendre et surmonter les limites de la régénération humaine rend la régénération de la biologie plus intrinsèquement intéressante.

Maintenant, avec l'utilisation des nouvelles technologies telles que le séquençage du génome et le gain et la perte d'outils de fonction, le champ est prêt à taquiner les mécanismes en dehors de régénération et de comprendre finalement comment diverses espèces peuvent se régénérer tandis que d'autres ne peuvent pas. Le degré de similitude dans les réponses moléculaires, cellulaires et morphologiques reste à élucider, mais jusqu'à présent, il semble que les réponses de base chez les animaux qui peuvent se régénérer est plus semblable que aurait été imagined seulement il y a ³ ans.

Cnidaires en particulier, sont facile à régénérer la quasi-totalité de leurs parties du corps au milieu d'un large éventail de la diversité morphologique. Du polype solitaire d'eau douce, Hydra ainsi que les petits polypes marins qui construisent d'immenses récifs coralliens, les siphonophores coloniales complexes, comme l'Homme-O-War portugais, la régénération est souvent un mode de reproduction, en plus d'un mécanisme de la réparation ou la réforme des parties du corps endommagées ou perdues résultant de blessures et de la prédation. Que les diverses espèces de cnidaires utilisent des mécanismes similaires ou différents pour la régénération est une question fondamentalement intéressante ^4-6.

Nous, et d' autres ont mis au point l'anthozoaire, Nematostella vectensis comme un modèle pour la régénération ^7-17. Nous avons récemment développé un système de mise en scène pour décrire la régénération d'un corps entier d'un morceau morphologiquement uniforme du tissu bissectrice des Aboral extrémité du polype ^10. Alors que les polypes Nematostella peuvent se régénérer quand bissectrice à tous les niveaux, nous avons choisi de couper les adultes à une position aboral dans la région la plus morphologiquement simple, la physe, en partie parce que cela est proche du plan normal de la fission naturelle et asexuée ^18, et aussi parce qu'il permet l'observation et des analyses moléculaires de la façon dont un corps entier est remonté à partir des composants les plus simples morphologiques.

Le système de stadification Nematostella Régénération (NRSS) fournit un ensemble relativement simple de repères morphologiques qui pourraient être utilisés pour marquer les progrès de tout aspect de la régénération par une physa amputée, dans des conditions normales de culture ou expérimentalement perturbé des situations telles que les petits traitements de molécules, les manipulations génétiques ou l'altération de l'environnement. Comme prévu, le NRSS est de plus adopté comme un échafaudage morphologique sur lequel les événements cellulaires et moléculaires de la régénération peuvent être référencées10.

Enfin , notre méthode de coupe produit un trou béant de plusieurs ordres de grandeur supérieure à la ponction de point de broches utilisé dans une étude récente ^17, mais les deux plaies à guérir dans environ 6 heures. Documenter les phases visuellement saisissantes et distinctes de fermeture de la plaie devrait suggérer des approches expérimentales pour expliquer l'apparente indépendance de la taille d'une blessure et le temps qu'il faut pour fermer. Ainsi, une compréhension visuelle plus profonde du processus d'amputation aboral, fourni par ce protocole, aidera d' autres investigations dans ce système de régénération de modèle et d' élargir l'application de ce système de mise en scène en utilisant Nematostella vectensis.

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Protocole

1. Conditionnement des animaux pour la température, la nutrition et la Lumière Cycle foncé /

1. Obtenir les adultes Nematostella de l'un des nombreux laboratoires dans le monde entier Nematostella, ou un fournisseur sans but lucratif (tableau 1)
2. Maintenir Nematostella à température constante (typiquement entre 18 et 21 ° C) dans l'obscurité, dans "1 / 3x" Artificial eau de mer (ASW) à une salinité de 12 parties par millier (ppt). Maintenir les cultures dans des plats simples sodocalcique culture en verre, généralement 250 ml ou 1,5 L capacité de ^11.
   Note: Ces conditions de culture simples sont couramment utilisés chez les laboratoires qui étudient Nematostella, mais les soins de culture peuvent également être automatisés ^19.
3. Parasites Nematostella Artemia fraîchement écloses nauplii 2 - 4x par semaine. Kystes Hatch Artemia à pleine puissance (36 ppt) ou 1 / 3x ASW à 30 ° C, dans un plat en verre rectangulaire peu profonde ²⁰ ou dansun nombre quelconque de petite échelle, les couvoirs artémias commerciales ou artisanales. Si un incubateur ne sont pas disponibles, les crevettes vont éclore à la température ambiante, mais le faire plus lentement.
   Remarque: Cela exige souvent plus de 24 h pour l'achèvement.
4. Remplacer l'eau de culture anémone au moins une fois par semaine. Pour une meilleure santé des adultes, bien propre (sans savon) la culture bols une fois par semaine des sécrétions muqueuses accumulées, qui enrobent le bol et peuvent piéger les aliments non consommés et des déchets, et enchevêtrer les animaux.

2. Sélection et Relaxation des animaux nutritionnellement Conditionné

1. Sélectionnez les polypes de taille appariés d'environ la même longueur (3 - 5 cm, quand naturellement détendu) et placez-les dans un bol séparé de la colonie pendant trois jours avant l'amputation.
   Remarque: Le nombre d'animaux sélectionnés pour la coupe sera déterminée par l'expérience menée, bien sûr, mais en général, nous recommandons au moins cinq animaux par point d'échantillon avec six répétitions. Ainsi,Dans une expérience typique d'un minimum de 30 animaux seraient choisis. En général, il est sage de choisir plus que le nombre minimum (30) depuis les amputations qui sont irrégulières (voir ci-dessous) peuvent ensuite affecter la notation.
2. Retirer le plat d'animaux sélectionnés de l'incubateur à la lumière ambiante au moins une heure avant l'amputation.
   Remarque: L'exposition à la lumière et les vibrations de la manipulation ambiante entraînera probablement les animaux à se contracter, de sorte qu'ils doivent être adaptés ou "détendue" par incubation sur le banc de laboratoire. Les animaux deviennent réfractaires au toucher et exposition à la lumière et à ce moment peuvent être déplacés par pipetage doux.
3. Facultatif: Anesthetize les animaux en ajoutant 7,5% MgCl ₂ (en 1 / 3x ASW). Ajouter délicatement la solution de _MgCl2 dans le bol avec une pipette en plastique mL 5 standard.
   Remarque: Bien que les animaux finiront par devenir accoutumés à la lumière et à la manipulation physique, il peut être avantageux pour anesthésier les animaux à maintenir ou à «fixer» til se détendit état après ils sont devenus ^16,21,22 allongé.
4. Utilisez un large alésage (> 0,5 cm) de pipette en plastique pour transférer (en 1 / 3x ASW) cinq animaux de la piscine à être amputé, dans le fond d'un plat de coupe de verre stérile de 100 mm de diamètre contenant 12 ppt ASW. Placer le plat sur la scène d'un stéréomicroscope avec grossissement variable entre 10 - 40X.
   Remarque: Si les animaux ne sont pas anesthésiés et détendu pour la coupe, ils peuvent encore répondre au toucher et à l'éclairage de stéréoscope et donc peut-être besoin de quelques minutes pour devenir à nouveau détendu.

3. Amputation

1. L'utilisation d'un scalpel stérile, amputer la physe aboral de chaque polype, dans le but d'obtenir une partie de la physe qui est à peu près aussi longtemps qu'il est large et ne contenant pas de mésentère.
   Remarque: Le site idéal de coupe est juste aboral à la résiliation du mésentère. Au plan de coupe il y a une transition de mésentère propre à l minceines correspondant à chaque insertion mésentérique (voir la figure 1, des flèches). Absence de mésentère est critique , car elle produit des muqueuses qui peuvent faciliter «brancher» le trou ^17,30.
   1. Placer la lame de scalpel en contact avec l'animal à l'emplacement désiré de l'amputation. Pour ce faire, soit sans aide (freehand), ou en saisissant doucement le corps de l'animal avec un # 5 forceps (style Dumont ou similaire).
   2. Couper à travers le tissu en tirant parti de la lame incurvée du scalpel dans un mouvement «à bascule» à travers le corps.
      Remarque: Le tissu doit couper proprement que le scalpel est secoué et de libérer la section désirée de physe du donneur. Toutefois, si un petit morceau de tissu relie encore le corps et la physe, le couper avec le scalpel. Ne pas essayer de séparer les morceaux connectés en tirant, car cela pourrait endommager la physe.
2. Retirez chaque «donneur» polype amputée de l'antenne et le retourner à un sepabol taux étiqueté «amputés» mis en commun; ce jour, le bol et le retourner à la culture de réserve.
   Note: les polypes Amputé vont guérir la plaie aboral dans un jour et peut ensuite être alimenté normalement. Ils régénérer un physa recherche normale dans les deux semaines à quel point le physa peut être amputé de nouveau si on le souhaite.
3. Rincer le physa excisée qui restent dans le plat de coupe dans 12 ppt ASW, puis transférer chaque physa à un puits stérile séparé dans une plaque de culture cellulaire multi-puits qui a déjà 10 ml de 12 ppt ASW dans chaque puits.
   Remarque: Cet exemple utilise une plaque de six, avec chaque puits détenant 10 ml d'eau de mer et cinq physa excisée. Dans l'eau de mer générale devrait couvrir la physe suffisamment pour éviter l'exposition à l'air due à la circulation dans la manipulation et l'évaporation potentielle. La plaque ou les puits doivent avoir un couvercle.
4. Répétez les étapes 3.1 à 3.3 pour recueillir au moins 5 physa dans chaque puits réservé pour chaque traitement expérimental.
5. Incuber la physe à une température qui fournide le meilleur taux de régénération pour les interrogatoires expérimentaux prévus. Placer la plaque contenant le physa dans un incubateur à température régulée, à une température fixe déterminée par le taux de régénération désiré.
   Remarque: Le physa va régénérer les tissus manquants et former un polype complet lorsqu'ils sont incubés à des températures entre 15 et 27 ° C. Le taux de régénération est dépendante de la température à l'exception des deux premières étapes. La journée moyenne pour atteindre l'étape 4 pour toutes les températures est de 7 jours après la coupe et cela coïncide aussi avec la régénération à 21 ° C. A 27 ° C, l'étape 4 est atteinte environ 3 jours plus tôt et à 15 ° C, l'étape 4 est retardé d'environ 3 d par rapport à la régénération à 21 ° C (voir également référence 10).

4. Évaluer la régénération avec le système de stadification Nematostella Régénération (NRSS)

1. Score du physa en utilisant un microscope stéréo-composé avec magnific variablesation (10 - 80X). Note de la physe Nematostella fraîchement coupée comme au stade 0 et continuer la notation à la même heure chaque amputation de poste de jour (dpa) en utilisant le NRSS ^10.
   Remarque: Pour les critères et les détails de mise en scène clés font référence référence 10.
   1. Note physa comme au stade 0 (Open Wound) si un physa fraîchement coupé apparaît comme une masse en forme de coupelle ressemblant à un ballon flasque, avec un site de plaie ouverte est susceptible visible.
      Remarque: Les bords de la plaie peut aussi coller ensemble dès le départ, mais le tissu sera toujours effondré et manquent de rigidité. Les bords de la plaie ouverte peuvent être observés subissant une contraction radiale que la blessure guérit.
   2. Note physa comme au stade 1 (Wound fermé) si la plaie d'amputation apparaît fermé.
      Remarque: l'emplacement de la plaie correspondra au pôle oral avenir. La surface extérieure autour du pôle oral avenir peut commencer à afficher des arcs distincts correspondant aux endodermiques radialement symétrique insertions mésentériques sous-jacentes.
   3. Score phYSA comme au stade 2 (radial arches) si la surface du pôle apparaît gonflé par voie orale, révélant huit arcs relief disposés selon un motif symétrique radialement et séparées par des rainures. Observer les petites bulles hémisphériques au sommet des arcs. Ils seront à peu près aussi haute que large, de passage probable, et initialement composé d'une couche de cellules ectodermiques unique.
      Remarque: Dans certains cas blebs double couche peuvent se stabiliser. Remarque: À ce ou tard met en scène une couche de mucus peut apparaître pour encapsuler le physa (Figure 2) dans une «gaine» membraneuse. Ce matériau d'encapsulation doit être enlevée pour faciliter la notation.
   4. Note physa comme au stade 3 (Tentacle) si les bourgeons des tentacules contenant des couches de tissus endodermiques et ectodermiques sont formés de manière stable à l'extrémité orale d'au moins quelques arcs radiaux.
      Remarque: Les tentacules sont plus longs que larges et sont peu mobiles. Le physa montrera une augmentation, mais l'inflation variable de sorte que rudiment mésentère peut devenir visible étendant à partir de l'insertion mésentérique dans la cavité du corps (cœlentéron).
   5. Note physa comme au stade 4 (mésos linéaires) si le physa contient huit, mésos visibles distincts qui se prolongent dans le cœlentéron d'insertions dans la paroi du corps, avec des longueurs orales-aboral qui sont plus de deux fois leur largeur radiale mesurée à partir de là où ils semblent se connecter au pharynx à son extrémité aboral (de enterostome).
      Remarque: Quatre ou moins mésos ont des bords libres internes "plissés". Le pharynx est visible. Plus de huit tentacules sont visibles, motile et parfois ils se contractent dans le corps.
   6. Note physa comme au stade 5 (prédominance plissés mésos) si la physe a plus de quatre mésos avec plissage, et le plissage est plus complète et sinueuse qu'à l'étape 4. L'animal a une apparence adulte presque «normal», mais il n'y a pas visible cellules gonadiques.

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Résultats

La progression des événements morphologiques pendant la régénération en physa coupée est représentée sur la figure 1A, qui comprend des vues représentatives de physa à chaque étape NRSS. Le site typique physa de coupe est indiquée sur l'adulte (pointes de flèches). Les photographies de la figure 1A montrent la régénération progressive des structures orales et le corps de physa fraîchement coupée par polype complètement formé.

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Discussion

Utilisation de Nematostella comme un modèle de cicatrisation des plaies et la régénération devient de plus en plus populaires. Par conséquent, il est important d'être en mesure de visualiser les modèles morphologiques d'un protocole particulier avant les analyses cellulaires et moléculaires efficaces peuvent être affectées et comparées. Nematostella ont un haut degré de régénération "flexibilité", être en mesure de réformer presque toute structure manquante amputée ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL	Carolina Biological Supply	741004	250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL	Carolina Biological Supply	741006	1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 - 40X magnification