Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Riepilogo

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Cnidari, e in particolare Hydra, sono stati i primi animali indicati per rigenerare le strutture danneggiate o mozzate, e in effetti questi studi probabilmente lanciati indagine biologica moderna attraverso il lavoro di Trembley più di 250 anni fa. Attualmente lo studio della rigenerazione ha visto una rinascita utilizzando entrambi i microrganismi rigenerativi "classici", come l'Hydra, planaria e urodeli, nonché uno spettro ampliamento di specie che misurano la gamma di metazoi, dalle spugne attraverso mammiferi. Oltre al suo interesse intrinseco come fenomeno biologico, la comprensione di come la rigenerazione lavora in una varietà di specie ci illustrerà se i processi rigenerativi condividono caratteristiche e / o specie comuni o meccanismi cellulari e molecolari specifici al contesto. L'anemone di mare starlet, Nematostella vectensis, è un organismo modello emergente per la rigenerazione. Come Hydra, Nematostella è un membro delle antiche phylum, Cnidaria, ma all'interno di tLa classe Anthozoa, un clade sorella al Hydrozoa che è evolutivamente più basale. Così gli aspetti della rigenerazione in Nematostella sarà interessante mettere a confronto con quelli di Hydra e altri cnidari. In questo articolo, vi presentiamo un metodo per bisect, di osservare e classificare la rigenerazione della fine aboral dell'adulto Nematostella, che si chiama il Physa. Il Physa subisce naturalmente la fissione come mezzo di riproduzione asessuata, e sia la fissione naturali o amputazione manuale del Physa innesca ricrescita e la riforma delle morfologie complesse. Qui abbiamo codificato questi semplici cambiamenti morfologici in un sistema di gestione temporanea Nematostella rigenerazione (il NRSS). Usiamo il NRSS per testare gli effetti di clorochina, un inibitore della funzione lisosomiale che blocca l'autofagia. I risultati mostrano che la rigenerazione delle strutture polipo, in particolare i mesenteri, è anormale quando autofagia è inibita.

Introduzione

L'osservazione della rigenerazione in un unico idra è stato l'evento seminale l'avvento della biologia come scienza sperimentale ^1,2. Rigenerazione rimane un fenomeno di straordinariamente ampio ricorso al biologo e laico allo stesso modo. Il potenziale di biologi dello sviluppo, medici, scienziati e ingegneri biomedici tessuti per comprendere e superare i limiti di rigenerazione umana rende biologia rigenerazione più di intrinsecamente interessante.

Ora, con l'uso di tecnologie emergenti come il sequenziamento del genoma e il guadagno e la perdita di strumenti di funzione, il campo è pronta a prendere in giro i meccanismi rigenerativi a parte e in ultima analisi, per capire come le varie specie in grado di rigenerare, mentre altri non possono. Il grado di comunanza di risposte molecolari, cellulari e morfologiche rimane da chiarire, ma finora sembra che le risposte di base tra gli animali che possono rigenerare è più simile di quanto sarebbe stato Imagined solo un decennio fa ^3.

Cnidari in particolare, sono facile a rigenerare quasi tutte le loro parti del corpo in mezzo a un ampio spettro di diversità morfologica. Dal solitari polipo acqua dolce, Hydra insieme con i minuscoli polipi marini che costruiscono enormi coralli, alle complesse sifonofore coloniale, come il portoghese Man-O-Guerra, la rigenerazione è spesso una modalità di riproduzione, in aggiunta a un meccanismo di la riparazione o la riforma parti del corpo danneggiate o perse derivanti da un infortunio e predazione. Se le diverse specie di Cnidaria utilizzano meccanismi simili o differenti per la rigenerazione è una domanda interessante fondamentalmente ^4-6.

Noi e altri abbiamo sviluppato il antozoo, Nematostella vectensis come modello per la rigenerazione ^7-17. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema di stadiazione per descrivere la rigenerazione di un intero corpo da un pezzo morfologicamente uniforme di tessuto tagliato in due dai Aboral fine del polipo ^10. Mentre polipi Nematostella possono rigenerare quando attraversata a qualsiasi livello, abbiamo scelto di tagliare adulti in posizione aboral nella regione più morfologicamente semplice, il Physa, in parte perché questo è vicino al piano normale della naturale fissione asessuata ^18, ed anche perché permessi osservazione e analisi molecolari di come un intero corpo viene ricomposto dai componenti morfologiche semplici.

Il Staging System Nematostella Regeneration (NRSS) fornisce una relativamente semplice serie di parametri morfologici che potrebbero essere utilizzati per segnare il progresso di qualsiasi aspetto della rigenerazione da un Physa amputata, in condizioni di coltura normali o sperimentalmente perturbato situazioni come trattamenti di piccole molecole, manipolazione genetica o alterazione ambientale. Come anticipato, il NRSS sta diventando adottato da impalcatura morfologica su cui è possibile fare riferimento gli eventi cellulari e molecolari della rigenerazione10.

Infine il nostro metodo di taglio produce un Gaping fori diversi ordini di grandezza superiore alla puntura fenomenale utilizzato in uno studio recente ^17, ma entrambe le ferite guariscono in circa 6 ore. Documentare le fasi visivamente arrestando e distinti di chiusura della ferita dovrebbe suggerire approcci sperimentali per spiegare l'apparente indipendenza della dimensione di una ferita e il tempo necessario per chiuderla. Così, una più profonda comprensione visiva del processo di amputazione aboral, fornita da questo protocollo, sarà di aiuto ulteriori indagini in questo sistema di rigenerazione del modello e ampliare l'applicazione di questo sistema di stadiazione utilizzando Nematostella vectensis.

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Protocollo

1. preparare gli animali per la temperatura, la nutrizione e la luce / buio ciclo

1. Ottenere Nematostella vectensis adulti da uno dei numerosi laboratori Nematostella in tutto il mondo, o un fornitore senza scopo di lucro (Tabella 1)
2. Mantenere Nematostella a temperatura costante (tipicamente tra 18 e 21 ° C) al buio, in "1 / 3x" artificiale del mare (ASW) ad una salinità di 12 parti per mille (ppt). Mantenere le culture in semplici soda-calce piatti di coltura in vetro, in genere da 250 ml o da 1,5 L di capacità ^11.
   Nota: Queste semplici condizioni di coltura sono comunemente utilizzati tra i laboratori che studiano Nematostella, ma la cura della cultura possono anche essere automatizzati ^19.
3. Alimentare Nematostella Artemia appena schiusi naupli 2 - 4 volte a settimana. Hatch Artemia cisti a piena forza (36 ppt) o 1 / 3x ASW a 30 ° C, in un poco profondo piatto di vetro rettangolare ²⁰ o inqualsiasi di un certo numero di piccola scala, gli incubatoi di salamoia gamberetti commerciale o fatti in casa. Se un incubatore non è disponibile, il gambero si schiudono a temperatura ambiente, ma lo fanno più lentamente.
   Nota: Questo richiede spesso più di 24 ore per il completamento.
4. Sostituire l'acqua cultura anemone, almeno una volta alla settimana. Per una migliore salute degli adulti, pulire accuratamente (senza sapone) la cultura bocce una volta alla settimana di secrezioni mucose accumulati, che rivestire la ciotola e possono intrappolare resti di cibo e rifiuti, e impigliare gli animali.

2. Selezione e rilassamento degli animali Nutrizionalmente condizionata

1. Selezionare i polipi di dimensioni corrispondenza di circa la stessa lunghezza (3 - 5 cm, quando naturalmente rilassato) e metterli in una ciotola separata dalla colonia per tre giorni prima di amputazione.
   Nota: Il numero di animali selezionati per il taglio sarà determinata dall'esperimento condotto, naturalmente, ma in generale si consiglia almeno cinque animali per punto di campionamento con sei repliche. Così,in un tipico esperimento un minimo di 30 animali sarebbe preselezionato. In generale, è consigliabile selezionare più di un numero minimo (30) dal amputazioni che sono irregolari (vedi sotto) in seguito possono influenzare punteggio.
2. Rimuovere il piatto di animali selezionati dal termostato in luce ambiente almeno un'ora prima amputazione.
   Nota: L'esposizione alla luce artificiale e vibrazioni di movimentazione probabilmente causerà gli animali a contrarsi, così hanno bisogno di essere adattati o "rilassato" di incubazione sul banco di laboratorio. Animali diventeranno refrattari al tatto e l'esposizione alla luce e, a quel punto può essere spostato delicatamente pipettando.
3. Opzionale: Anestetizzare gli animali con l'aggiunta di 7,5% MgCl ₂ (in 1 / 3x ASW). Delicatamente aggiungere la soluzione MgCl ₂ alla ciotola con uno standard di plastica 5 ml pipetta.
   Nota: Anche se gli animali finirà per diventare abituati alla luce e alla manipolazione fisica, può essere vantaggioso per anestetizzare gli animali per mantenere o "fissare" tsi rilassò stato dopo la loro entrata ^16,21,22 allungata.
4. Utilizzare un ampio foro (> 0.5 cm) pipetta di plastica per il trasferimento (in 1 / 3x ASW) cinque animali dalla piscina essere amputata, sul fondo di un piatto sterile taglio del vetro del diametro di 100 mm contenente 12 ppt ASW. Porre la capsula sul palcoscenico di uno stereomicroscopio con ingrandimento variabile tra i 10 - 40X.
   Nota: Se gli animali non sono stati anestetizzati e rilassato per il taglio, essi possono ancora rispondere al tatto e l'illuminazione stereoscopio, e quindi potrebbe essere necessario qualche minuto per diventare di nuovo rilassato.

3. Amputazione

1. Usando un bisturi sterile, amputazione l'Physa aboral da ciascun polipo, con l'obiettivo di ottenere una sezione del Physa che è circa fintanto che è ampia e non contenente mesentere.
   Nota: Il sito taglio ideale è solo aboral alla cessazione del mesentere. Al piano di taglio c'è una transizione da mesentere propria sottile lines corrispondente ad ogni inserzione mesenterial (vedere Figura 1, frecce). L'assenza di mesentere è fondamentale perché produce muco che possono facilitare 'collegare' il buco ^17,30.
   1. Posizionare il bisturi in contatto con l'animale al sito desiderato di amputazione. Fate questo sia autonomamente (a mano libera), oppure afferrando delicatamente il corpo dell'animale con un # 5 pinze (stile Dumont o simili).
   2. Tagliare il tessuto sfruttando la lama curva del bisturi in un movimento 'dondolo' in tutto il corpo.
      Nota: Il tessuto deve recidere pulito come il bisturi viene scosso e liberare la sezione desiderata Physa dal donatore. Tuttavia, se un piccolo pezzo di tessuto collega ancora il corpo e la Physa, tagliare con il bisturi. Non tentare di separare i pezzi collegati tirando, in quanto ciò potrebbe danneggiare il Physa.
2. Rimuovere ogni 'donatore' polipo amputato dal piatto e restituirlo ad un sepaciotola tasso etichettato 'amputati messe in comune; data la ciotola e restituirlo al magazzino della cultura.
   Nota: polipi amputate guarirà la ferita aboral entro un giorno e quindi può essere alimentato normalmente. Saranno rigenerare un normale Physa cercando entro due settimane a questo punto il Physa può essere amputata di nuovo se lo si desidera.
3. Risciacquare il Physa asportato che rimangono nel piatto di taglio 12 ppt ASW, quindi trasferire ciascuna Physa ad un pozzo sterile separata in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo che ha già 10 mL di 12 ppt ASW in ciascun pozzetto.
   Nota: Questo esempio utilizza una piastra ben sei, con ogni ben di detenzione di 10 ml di acqua di mare e cinque Physa asportato. In acqua marina generale dovrebbe coprire il Physa in misura sufficiente a evitare l'esposizione all'aria a causa di movimenti durante la movimentazione e il potenziale di evaporazione. La piastra o pozzetti devono avere un coperchio.
4. Ripetere i passaggi 3,1-3,3 per raccogliere almeno 5 Physa in ogni pozzetto riservato per ogni trattamento sperimentale.
5. Incubare la Physa ad una temperatura che si provide il miglior tasso di rigenerazione per gli interrogatori sperimentali previste. Posizionare la piastra contenente la Physa in un incubatore temperatura regolata, ad una temperatura fissa determinata dal tasso desiderato di rigenerazione.
   Nota: Il Physa sarà rigenerare i tessuti mancanti e formare un polipo pieno quando incubate a temperature comprese tra 15 e 27 ° C. Il tasso di rigenerazione dipende dalla temperatura eccezione per le prime due fasi. Il giorno medio per raggiungere la fase 4 per tutte le temperature è 7 d dopo il taglio e questo coincide anche con rigenerazione a 21 ° C. A 27 ° C, la fase 4 è raggiunto circa 3 giorni prima e a 15 ° C, la fase 4 è in ritardo di circa 3 d rispetto alla rigenerazione a 21 ° C (vedi anche Riferimento 10).

4. Valutare rigenerazione con la Staging System Nematostella Regeneration (NRSS)

1. Punteggio ottenuto il Physa utilizzando un microscopio stereo composto con magnifica variabilezione (10 - 80X). Punteggio ottenuto il Physa Nematostella appena tagliata come Stadio 0 e continuare segnando allo stesso tempo ogni amputazione dopo giorno (dpa) utilizzando il NRSS ^10.
   Nota: Per i criteri di stadiazione chiave e informazioni si riferiscono riferimento 10.
   1. Punteggio Physa come Stadio 0 (ferita aperta) se un Physa appena tagliata appare come una massa a forma di tazza- simile ad un palloncino flaccida, con un sito ferita aperta è probabile visibile.
      Nota: I bordi della ferita potrebbe anche stare insieme fin dall'inizio, ma il tessuto sarà ancora crollato e la mancanza di rigidità. I bordi della ferita aperta possono essere osservati in fase di contrazione radiale come la ferita guarisce.
   2. Punteggio Physa come fase 1 (Wound chiuso) se la ferita amputazione appare chiusa.
      Nota: posizione della ferita sarà conforme a futuro polo orale. La superficie esterna intorno al futuro polo orale può iniziare a visualizzare archi distinti corrispondenti ai sottostanti radialmente simmetrica endodermico inserimenti mesenterial.
   3. punteggio physa come Fase 2 (radiali Archi) se la superficie del polo orale appare gonfiato, rivelando otto archi sollevate disposti in uno schema radialmente simmetrica e separate da scanalature. Osservare piccoli, blebs emisferiche all'apice delle arcate. Saranno circa alto come ampia, probabilmente transitoria, e inizialmente composta da un singolo strato di cellule ectodermica.
      Nota: In alcuni casi, vesciche a doppio strato possono stabilizzarsi. Nota: A questo o poi mette in scena uno strato mucoso può apparire per incapsulare il Physa (figura 2) in una 'guaina' membranosa. Questo materiale inglobante dovrebbe essere rimosso per facilitare competenza.
   4. Punteggio Physa come Fase 3 (Tentacle) se le gemme dei tentacoli contenenti endodermico e ectodermiche strati di tessuto sono stabilmente formate alla fine orale di almeno alcuni archi radiali.
      Nota: I tentacoli sono più lunghi che larghi e sono minimamente mobili. Il Physa manifestano una maggiore, ma l'inflazione variabile in modo che rudimenti mesentere può diventare visbile estende dall'inserzione mesenterial nella cavità del corpo (coelenteron).
   5. Punteggio Physa come Fase 4 (Mesenteri lineari) se il Physa contiene otto distinti, mesenteri visibili che si estendono nel coelenteron dal inserimenti nella parete del corpo, con lunghezze orali-aboral che sono più di due volte la loro larghezza radiale misurata dal punto in cui compaiono per la connessione alla faringe alla sua estremità aboral (enterostome).
      Nota: quattro o meno mesenteri hanno "pieghe" bordi liberi interni. La faringe è visibile. Più di otto tentacoli sono visibili, mobili e talvolta si contraggono nel corpo.
   6. Punteggio Physa come Fase 5 (prevalentemente Pieghe Mesenteri) se il Physa ha più di quattro mesenteri con pieghe, e la pieghettatura è più piena e sinuosa che in fase 4. L'animale ha un quasi "normale" aspetto adulto, ma non ci sono visibili cellule gonadica.

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Risultati

La progressione degli eventi morfologici durante la rigenerazione in Physa tagliata è mostrato in figura 1A, che include viste rappresentativi di Physa in ciascuna fase NRSS. Il sito tipico Physa taglio è indicato l'adulto (punte di freccia). Le fotografie di Figura 1A mostrano progressiva rigenerazione delle strutture orali e corpo da Physa appena tagliata attraverso polipo completamente formato. Figura 1B, C mostrano la disposizi...

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Discussione

L'utilizzo di Nematostella come modello di guarigione delle ferite e la rigenerazione sta diventando sempre più popolare. Pertanto, è importante essere in grado di visualizzare i modelli morfologici di un particolare protocollo prima analisi cellulari e molecolari efficaci possono essere assegnati e confrontati. Nematostella hanno un alto grado di rigenerazione "flessibilità", potendo riformare quasi ogni struttura mancante amputati in qualsiasi luogo, nelle fasi post-planula di vita. ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL	Carolina Biological Supply	741004	250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL	Carolina Biological Supply	741006	1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 - 40X magnification