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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Zusammenfassung

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Einleitung

The two most reliable methods of identifying radiation-induced inter-chromosomal stable aberrations are multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH), which allows the painting of two or more chromosomes simultaneously, and spectral karyotyping (SKY), which imparts a distinct color to each homologous chromosome pair in the genome. Unlike unstable aberrations, stable aberrations are persistent in nature and may be propagated for several generations in irradiated populations1, and are regarded as critical molecular "signatures" of radiation-induced cytogenetic lesions2. Studies by various groups have shown that stable aberrations are associated with the pathogenesis and development of a number of diseases, including cancer3. Before the era of chromosome painting (also referred as molecular cytogenetics), the conventional G-banding technique was the only method for detecting stable chromosomal aberrations. However, chromosome banding is a challenge to cytogeneticists because the resolution is limited, reproducibility is uncertain, it is a labor-intensive procedure, and it requires highly skilled and experienced cytogeneticists for reliable data interpretation4. Moreover, the classic banding technique does not allow detection of complex chromosomal rearrangements, which involve the interaction of three or more breaks distributed among two or more chromosomes, a common outcome of radiation damage. Complex aberrations may persist in individuals many years after radiation exposure, making them useful for retrospective biodosimetry5. Therefore, an alternate approach was required to overcome the limitations of conventional banding techniques to detect stable chromosomal rearrangements.

In the late 1960s, the pioneering work of Gall and Pardue (1969) on molecular hybridization using nucleic acid probes labeled with radioactive material commenced a new era in the field of cytogenetics, which allowed detection of a specific DNA sequence on chromosomes6. However, the use of radioactive probes for molecular hybridization had several drawbacks: radioactive probes are relatively unstable, probe activity depends on radioactive decay of the isotope used, hybridization takes a longer time, the resolution is limited, the probes are relatively costly, and the radioactive materials are a health hazardous. Thus, it became necessary to develop and design non-radioactive probes. The introduction of fluorescent tagged nucleic acid probes in the 1980s and 1990s overcame the limitations of radioactive probes and greatly enhanced the safety, sensitivity, and specificity of the hybridization technique7-10. Fluorescent probes give rise to extremely bright signals when observed under fluorescence microscopes equipped with the appropriate excitation and emission filters. Any loss, gain, or rearrangement of fluorescent labeled chromosome/s or a part of the chromosome is easily identifiable with this FISH technique.

Analysis of chromosomal aberrations by FISH painting has led to marked progress in cytogenetic research over the years. Designing fluorescent labeled probes for specific applications ranging from locus-specific probes to whole-chromosome painting probes has advanced the field significantly; this has also facilitated the detection of submicroscopic ("cryptic") rearrangement, which was not possible by conventional chromosome banding. Chromosome painting by mFISH and SKY have proven to be valuable tools for the identification of simple and complex inter-chromosomal rearrangements. The basic principles for both techniques are similar, but the method of detection and discrimination of fluorescent signal after in situ hybridization and the process of image acquisition are different. In mFISH, separate images of each of the four fluorochromes are captured by using narrow bandpass microscope filters; dedicated software is then used to combine the images. While in SKY, image acquirement is based on a combination of epifluorescence microscopy, charge-coupled device imaging, and Fourier spectroscopy, which allows the measurement of the entire emission spectrum with a single exposure at all image points. In both mFISH and SKY, monochrome images are captured independently, then merged, and finally, unique pseudo-colors are assigned to the chromosomes in monochromatic images based on the specific dye attached to each fluorochrome probe.

The contribution of mFISH and SKY analysis in the radiation biology field is remarkable, particularly for retrospective dose estimation of human exposure to IR (radiation biodosimetry)11-14, radiation carcinogenesis risk assessment15, as well as detection and risk estimation of radiotherapy-related secondary cancer16. A recent study on mice has shown that a FISH-based chromosome painting technique is also an important tool for evaluating the efficacy of radiation countermeasure17. In the present study, the effect of total body radiation exposure on the induction of stable chromosomal aberrations in the bone marrow cells of mice has been demonstrated using mFISH and SKY techniques.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Tier Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arkansas for Medical Sciences genehmigt. 15 Stundentakt von frischer Luft und den freien Zugang zu Standard-Nagerfutter und Wasser - Alle Tiere wurden mit 10 bei 20 ± 2 ° C unter Standard klimatisierten Tieranlage untergebracht. Bei der Ankunft wurden die Mäuse für 1 Woche in Quarantäne gehalten und zertifiziertes Nagerfutter zur Verfügung gestellt.

1.Radiation Belichtung und In - vivo - Arrest von Metaphasezellen

  1. Expose un-narkotisierten Mäusen 2 Gy Ganzkörperbestrahlung in einer Bestrahlungskammer. Während der Bestrahlung statt Mäuse in einem gut belüfteten Aufnahmekammer sicherstellen, dass sie sich nicht frei bewegen und eine einheitliche Dosis erhalten.
  2. Inject 100 ul von 0,05% Colchicin-Lösung (colchicine Pulver Calcium und Magnesium-freiem PBS gelöst in) intraperitoneal unter Verwendung einer 25 G Nadel befestigt mit 1 ml Einwegspritze. Vermeiden Sie direkte Injektion in jedem Organ.
  3. Lassen Sie das Tier in den Käfig für 2 h vor Knochenmarkzellernte. Beobachten Sie das Tier auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden.

2. Knochenmarkzellernte und Isolierung von Knochenmark mononukleären Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation

  1. Euthanize die Maus durch CO 2 Ersticken.
  2. Spray 70% Ethanol auf der dorsalen und ventralen Seite.
  3. Machen Sie eine 2 cm lange Inzision auf der Bauchhaut mit einer scharfen Schere. Fassen Sie die Haut auf beiden Seiten des Einschnitts mit stumpfen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Bauchmuskeln zu öffnen.
  4. Schneiden Sie sowohl die Hinterbeine mit einer Schere und sofort legen Sie sie in vorgekühlte PBS mit 4% FBS.
  5. sorgfältig reinigen, alle an den hinteren Gliedmaßen mit einem scharfen Rasierklinge und Baumwolle Mullbinde ansetzenden Muskeln.
  6. Trennen Sie die Tibia vom Femur. Schneiden Sie die beiden Spitzen jedes Knochen mit einer Rasierklinge.
  7. Spülen des Inhalts des Knochenmarks mit 3 ml PBS (mit 4% FBS) unter Verwendung einer 23 G-Nadel an einer 3 ml Spritze und sammeln den Inhalt in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Übergeben Sie die Zellsuspension mindestens 10 Mal durch die Nadel eine Einzelzellsuspension zu machen.
  8. Overlay sorgfältig die Zellsuspension auf einem gleichen Volumen von Lymphozytentrennmedium (3 ml), ohne die Schnittstelle zwischen der Zellsuspension und Lymphozyten-Separationsmedium zu stören. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei Raumtemperatur.
  9. Sammeln Sie die Leukozytenmanschette vorsichtig, ohne zu stören die anderen Schichten und die Übertragung in einem neuen 15 ml Zentrifugenröhrchen.

3. Herstellung von Metaphase Zelle Aufstriche

  1. 10 mL PBS auf das Rohr die buffy coat enthält.
  2. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann brechen ter Pellet mit leichtes Klopfen Zelle und 10 ml PBS hinzufügen.
  4. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Entfernen Sie den Überstand ohne das Zellpellet zu stören, brechen das Pellet auf, und 4 ml vorgewärmten hypotone 0,075 M Kaliumchloridlösung. In hypotone Lösung tropfenweise mit sanften konstantem Schütteln.
  6. Inkubiere Zellen für 20 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
  7. Nach dem hypotonischer Behandlung, ein gleiches Volumen (4 ml) Fixiermittel (Methanol: Eisessig, 3: 1 v / v) vorsichtig in den 15 ml-Röhrchen und mischen Sie den Schlauch durch Umkehren.
  8. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen.
  9. Brechen Sie das Zellpellet mit von sanften Wirbel für ein paar Sekunden, gefolgt tippen und 3 ml Fixierungslösung tropfenweise mit konstantem Schütteln.
  10. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur und dann bei 400 xg für 5 min zentrifugieren.
  11. Entfernen Sie den Überstand, brechen die Zellpellet mit gent uple tippen und 3 ml frisches Fixiermittel.
  12. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand. Brechen Sie das Zellpellet mit leichtes Klopfen auf, und fügen Sie frische 3 ml Fixiermittel.
  13. Wiederholen Sie Schritt 3.12 zweimal.
  14. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Entfernen von Überstand ohne das Zellpellet zu stören. Dann fügen Sie 400 bis 600 & mgr; l Fixiermittel und gründlich mischen mit Pipettieren.
  15. Drop-30 & mgr; l fixierten Zellen auf vorgereinigte und nassen Rutschen bei einem Winkel von 45 ° geneigt und lassen Sie die Folien an der Luft trocknen über Nacht vollständig.

4. Maus Chromosome Painting von MFISH

  1. Chromosome Denaturierung
    1. Legen Sie die Folie mit der Metaphase Zelle Aufstriche in 2 × SSC für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
    2. Entwässern Sie die Folie durch serielle Ethanol Waschen für jeweils 2 Min in 70%, 80% und 100%. bei 65 ° C für 60 min inkubieren.
    3. Vorheizen 40 ml Denaturierungslösung (70% Formamid / 2x SSC; pH 7,0) auf 70 ° C (± 2 ° C) in einem Glas Coplin jar für 30 min. Denaturieren Chromosomen durch die Folie in vorgewärmten Denaturierungslösung Inkubation mit 1 - 1,5 min.
    4. Quench rutschen sofort in eiskaltem 70% Ethanol für 2 min die Denaturierung als auch zu stoppen, zu verhindern, dass die denaturierten Chromosomen wieder Glühen. Dann Dehydratisieren mit 80% Ethanol für 2 min durch Waschen. Wiederholen des Ethanols Wäsche mit 100% Ethanol für 2 min. vollständig trocknen die Folie bei Raumtemperatur.
  2. Denaturierung und Hybridisierung der Sonde Mischung
    1. Kurz die Sondenmischung vom Hersteller geliefert, Zentrifuge, übertragen 10 & mgr; l Probenmischung in einen 500 & mgr; l Kappe Zentrifugenröhrchen schnappen, und für 7 min bei 80 ° C (± 2 ° C) in einem Wasserbad durch Inkubation denaturieren.
    2. Platzieren Sie die Zentrifugenröhrchen mit Probenmischung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 10 min.
    3. Tragen Sie die denaturierte Sonde Mischung auf den Objektträger mit denaturierten chromosomes.
    4. Deckel vorsichtig den Bereich mit einem 18 mm x 18 mm Deckglas und beseitigen alle sichtbaren Luftblasen durch sehr sanft das Deckglas drücken gleiten. Dichten Sie alle vier Seiten des Deckglases mit Gummizement und Inkubation für 12 h bis 16 h im Dunkeln bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer für die Hybridisierung.
  3. Beitrag Hybridization Waschen und Nachweis
    1. Entfernen Sie vorsichtig den Gummizement und das Deckglas.
    2. Ort Schieber in vorgewärmten 0,4x SSC bei 74 ° C (± 2 ° C) für 5 min.
    3. Wasch slide in Waschlösung II (4x SSC / 0,1% Tween-20) für 2 min.
    4. Legen Sie 20 & mgr; l anti-fade Eindeckmedium mit DAPI counterstain (1,5 ug / ml) geben und mit einem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig auf Deckglas mit Labor Gewebe, um Luftblasen und überschüssige Montagelösung zu entfernen. Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack.
    5. Blick gleitet ein Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern.

5. Spektrale Karyotypisierung (SKY) von Maus-Chromosome

  1. Chromosome und Probe Denaturierung
    1. Äquilibrieren Folie in 2x SSC bei Raumtemperatur für 2 Minuten, ohne Schütteln.
    2. Dehydratisieren Folie in einer Ethanolreihe (70%, 80% und 100% Ethanol) für 2 min jeweils bei Raumtemperatur. Der Luft trocknen die Folie, um das Ethanol vollständig zu entfernen.
    3. Warme 40 ml Denaturierungslösung (70% Formamid / 2 × SSC, pH 7,0) in einem Glas Glasküvette 30 min.
    4. Inkubiere Objektträger in vorgewärmten Denaturierungslösung für 1 bis 1,5 min.
    5. Tauchen Sie sofort das Abgleiten in eiskaltem 70% Ethanol für 2 min die Denaturierung als auch zu stoppen, wie auf die denaturierten Chromosomen wieder Glühen verhindern.
    6. Entwässern die Folie, indem sie in 80% Ethanol für 2 min und dann in 100% Ethanol für 2 min bei Raumtemperatur setzt.
    7. Denaturieren die SKY-Sonde (Vial # 1 durch Hersteller mitgeliefert) in einem Wasserbad auf 80 ° C (± 2 ° C)7 min, und legen Sie dann sofort in ein anderes Wasserbad für 10 min auf 37 ° C eingestellt.
  2. Sondenhybridisierung
    1. Fügen Sie 10 ul der denaturierten SKY-Sonde auf die denaturierten Chromosomen.
    2. eine 18 mm x 18 mm Deckglas auf den SKY-Sonde vorsichtig platzieren, so dass keine Luftblasen unter dem Deckglas gefangen sind.
    3. Seal die Ränder des Deckglases mit Gummi-Zement.
    4. Legen Sie die Folie in einer angefeuchteten lichtundurchlässigen Kammer und Inkubation im Dunkeln bei 37 ° C für 24 h bis 36 h.
  3. Post-Hybridisierung Waschen und Fluoreszenzdetektion
    1. Entfernen Sie Gummizement sehr vorsichtig, ohne das Deckglas zu stören.
    2. Legen Sie die Folie in vorgewärmten schnelle Waschlösung (0,4x SSC) bei 72 ° C (± 2 ° C) für 5 min unter konstantem Schütteln. Tauchen Abgleiten in die Waschlösung III (4x SSC / 0,1% Tween 20) und Inkubation für 1 min unter Schütteln.
    3. Optional: Fügen Sie 80 ul Blockingreagenz(Flasche # 2 durch Hersteller mitgeliefert) auf dem Gebiet der Hybridisierung, legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und für 30 min in einer feuchten Kammer bei 37 ° C im Dunkeln inkubiert.
    4. Sie vorsichtig die Kunststoffdeckglas entfernen und den Schlitten mit vorgewärmten (45 ° C) Waschlösung III 5 min waschen.
    5. Bewerben 80 ul von Cy5 Färbungsreagens (Fläschchen # 3 durch Hersteller geliefert), legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und bei 37 ° C im Dunkeln für 40 min in einer feuchten Kammer.
    6. Tauchen Sie den Schlitten in ein Glas Coplin Gefäß mit vorgewärmten (45 ° C) Waschlösung III (4x SSC / 0,1% Tween 20) und Inkubation bei 45 ° C in einem Wasserbad für 2 Minuten unter Schütteln. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal.
    7. Bewerben 80 ul von Cy5.5 Färbungsreagens (Fläschchen # 4 durch Hersteller geliefert), legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und bei 37 ° C im Dunkeln für 40 min in einer feuchten Kammer.
    8. Waschen Sie die Schieber 3 mal mit vorgewärmten (45 ºC) Waschlösung III.
    9. Halten Sie die Folie in einer gekippten Position gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit abfließen kann. In 20 & mgr; l anti-fade DAPI-Reagenz (Fläschchen # 5 vom Hersteller geliefert) und legen Sie vorsichtig mit einem 24 mm x 60 mm Deckglas ohne Luftblasen einzuführen. Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack und beobachten mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop für die Erfassung von SKY Bilder ausgestattet.

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Ergebnisse

Gesamtkörperbestrahlung induziert zahlreiche Chromosomenaberrationen in den Knochenmarkzellen von bestrahlten Mäusen. Das aktuelle Protokoll wird für die in - vivo - mitotischen Arrest von Knochenmarkzellen nach Strahlenexposition optimiert, Ernte von Knochenmarkszellen von den Hinterbeinen von bestrahlten Mäusen, die Isolierung von Knochenmark mononukleären Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation, die Vorbereitung der Metaphase Zelle ausbreitet, und die anschl...

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Diskussion

Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg von MFISH und SKY. Der erste und wichtigste Schritt ist es, die Colchicin - Behandlung für in vivo mitotischen Arrest der Knochenmark mononukleäre Zellen zu optimieren. Die Colchicin Konzentration und die Behandlungszeit der mitotischen Index sowie Chromosomenkondensation-zwei wichtige Voraussetzungen für eine effektive chromosome painting einzeln oder gemeinsam bestimmen. Eine hohe Konzentration Colchicin oder längere Behandlungszeit führt zu hoch kondensiert...

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Offenlegungen

The authors declare that they have no competing financial interests.

Danksagungen

Diese Studie wurde von Arkansas Raum Grants Consortium und National Space Biomedical Research Institute durch National Aeronautics and Space Administration unterstützt wurde, gewährt NNX15AK32A (RP) und RE03701 (MH-J) und P20 GM109005 (MH-J) und die US Veterans Administration ( MH-J). Wir danken Christopher Fettes, Programm-Koordinator für die Abteilung für Umwelt- und Arbeitsmedizin an der University of Arkansas for Medical Sciences, für redaktionelle Unterstützung bei der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
FormamideSigma-Aldrich221198-100ML
SSC Buffer 20× ConcentrateSigma-AldrichS6639-1L
SKY Laboratory Reagent for MouseApplied Spectral ImagingFPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection KitApplied Spectral ImagingFPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
Glass coverslipsFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw CapFisher Scientific08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution Life Technologies10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Colcemid powderFisher Scientific50-464-757 
Histopaque-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiatorJ. L. Shepherd & AssociatesModel 484B
Syringe 1 mLBD Biosciences647911
Ethyl Alcohol, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and MagnesiumFisher ScientificICN1860454
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10-437-010
MethanolFisher ScientificA454SK-4
Glacial acetic acidFisher ScientificAC295320010
Zeiss MicroscopeZeissAXIO Imager.Z2

Referenzen

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