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Resumo

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Resumo

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Introdução

The two most reliable methods of identifying radiation-induced inter-chromosomal stable aberrations are multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH), which allows the painting of two or more chromosomes simultaneously, and spectral karyotyping (SKY), which imparts a distinct color to each homologous chromosome pair in the genome. Unlike unstable aberrations, stable aberrations are persistent in nature and may be propagated for several generations in irradiated populations1, and are regarded as critical molecular "signatures" of radiation-induced cytogenetic lesions2. Studies by various groups have shown that stable aberrations are associated with the pathogenesis and development of a number of diseases, including cancer3. Before the era of chromosome painting (also referred as molecular cytogenetics), the conventional G-banding technique was the only method for detecting stable chromosomal aberrations. However, chromosome banding is a challenge to cytogeneticists because the resolution is limited, reproducibility is uncertain, it is a labor-intensive procedure, and it requires highly skilled and experienced cytogeneticists for reliable data interpretation4. Moreover, the classic banding technique does not allow detection of complex chromosomal rearrangements, which involve the interaction of three or more breaks distributed among two or more chromosomes, a common outcome of radiation damage. Complex aberrations may persist in individuals many years after radiation exposure, making them useful for retrospective biodosimetry5. Therefore, an alternate approach was required to overcome the limitations of conventional banding techniques to detect stable chromosomal rearrangements.

In the late 1960s, the pioneering work of Gall and Pardue (1969) on molecular hybridization using nucleic acid probes labeled with radioactive material commenced a new era in the field of cytogenetics, which allowed detection of a specific DNA sequence on chromosomes6. However, the use of radioactive probes for molecular hybridization had several drawbacks: radioactive probes are relatively unstable, probe activity depends on radioactive decay of the isotope used, hybridization takes a longer time, the resolution is limited, the probes are relatively costly, and the radioactive materials are a health hazardous. Thus, it became necessary to develop and design non-radioactive probes. The introduction of fluorescent tagged nucleic acid probes in the 1980s and 1990s overcame the limitations of radioactive probes and greatly enhanced the safety, sensitivity, and specificity of the hybridization technique7-10. Fluorescent probes give rise to extremely bright signals when observed under fluorescence microscopes equipped with the appropriate excitation and emission filters. Any loss, gain, or rearrangement of fluorescent labeled chromosome/s or a part of the chromosome is easily identifiable with this FISH technique.

Analysis of chromosomal aberrations by FISH painting has led to marked progress in cytogenetic research over the years. Designing fluorescent labeled probes for specific applications ranging from locus-specific probes to whole-chromosome painting probes has advanced the field significantly; this has also facilitated the detection of submicroscopic ("cryptic") rearrangement, which was not possible by conventional chromosome banding. Chromosome painting by mFISH and SKY have proven to be valuable tools for the identification of simple and complex inter-chromosomal rearrangements. The basic principles for both techniques are similar, but the method of detection and discrimination of fluorescent signal after in situ hybridization and the process of image acquisition are different. In mFISH, separate images of each of the four fluorochromes are captured by using narrow bandpass microscope filters; dedicated software is then used to combine the images. While in SKY, image acquirement is based on a combination of epifluorescence microscopy, charge-coupled device imaging, and Fourier spectroscopy, which allows the measurement of the entire emission spectrum with a single exposure at all image points. In both mFISH and SKY, monochrome images are captured independently, then merged, and finally, unique pseudo-colors are assigned to the chromosomes in monochromatic images based on the specific dye attached to each fluorochrome probe.

The contribution of mFISH and SKY analysis in the radiation biology field is remarkable, particularly for retrospective dose estimation of human exposure to IR (radiation biodosimetry)11-14, radiation carcinogenesis risk assessment15, as well as detection and risk estimation of radiotherapy-related secondary cancer16. A recent study on mice has shown that a FISH-based chromosome painting technique is also an important tool for evaluating the efficacy of radiation countermeasure17. In the present study, the effect of total body radiation exposure on the induction of stable chromosomal aberrations in the bone marrow cells of mice has been demonstrated using mFISH and SKY techniques.

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Protocolo

Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Todos os animais foram alojados em instalações para animais com ar condicionado padrão a 20 ± 2 ° C com 10 - 15 ciclos de uma hora de ar fresco e livre acesso à alimentação padrão para roedores e água. Após a chegada, os ratos foram mantidos em quarentena por uma semana e desde ração para roedores certificado.

Exposição 1.Radiation e In Vivo Detenção de células em metafase

  1. ratos expor un-anestesiados com 2 Gy de radiação de corpo inteiro em uma câmara de irradiação. Durante a irradiação, colocar ratos em uma câmara de retenção bem ventilado para garantir que eles não se movem livremente e receber uma dose uniforme.
  2. Injectar 100 ul de solução de colchicina a 0,05% (Cpó olchicine dissolvido em cálcio e magnésio livre PBS) por via intraperitoneal usando uma agulha 25 G anexo com 1 mL seringa descartável. Evitar a injeção diretamente em qualquer órgão.
  3. Deixar o animal na gaiola durante 2 h antes da colheita de células de medula óssea. Observar o animal para detectar quaisquer sinais de dor ou sofrimento.

2. Colheita da medula celular e Isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade

  1. Euthanize o mouse por asfixia com CO2.
  2. Spray de etanol a 70% sobre o lado ventral e dorsal.
  3. Adicione de 2 cm da incisão na pele abdominal com uma tesoura afiada. Segure a pele em ambos os lados da incisão com uma pinça sem corte e puxe abrir os músculos abdominais.
  4. Cortar ambas as patas traseiras com uma tesoura e coloque-os imediatamente na pré-refrigerados PBS com 4% de FBS.
  5. Limpe cuidadosamente todos os músculos ligados à pata traseira com uma lâmina de barbear e gaze de algodão bandage afiada.
  6. Separe a tíbia do fêmur. Apare as duas pontas de cada osso com uma lâmina de barbear.
  7. Lavar o conteúdo da medula óssea com 3 mL de PBS (com 4% de FBS), utilizando uma agulha de 23 G ligada a uma seringa de 3 ml e recolher o conteúdo num tubo de centrífuga de 15 mL. Passar a suspensão de células, pelo menos, 10 vezes, através da agulha para fazer uma suspensão de células individuais.
  8. Cuidadosamente sobrepor a suspensão de células em um volume igual de meio de separação de linfócitos (3 mL), sem perturbar a interface entre a suspensão de células e meio de separação de linfócitos. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente.
  9. Recolher o creme leucocitário cuidadosamente, sem perturbar as outras camadas e transferência em um novo tubo de centrífuga de 15 mL.

3. Preparação de Spreads celular Metaphase

  1. Adicionar 10 ml de PBS ao tubo contendo o buffy coat.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, quebrar-se tele célula pellet com toque suave e adicionar 10 mL PBS.
  4. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular, quebrar-se o sedimento, e adicionar 4 ml de solução de cloreto de potássio 0,075 M hipotónica pré-aquecido. Adicionar gota solução hipotônica a gota, com agitação constante suave.
  6. Incubar as células durante 20 min a 37 ° C num banho de água.
  7. Após o tratamento hipotónico, adicionar um volume igual (4 ml) do fixador (metanol: ácido acético glacial, 3: 1 v / v) no tubo de 15 mL e misturar suavemente por inversão do tubo.
  8. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
  9. Quebra-se o agregado de células com batimento seguido de vortex suave durante alguns segundos e adicionar 3 mL de gota solução fixadora a gota, com agitação constante.
  10. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugar a 400 xg durante 5 min.
  11. Remover o sobrenadante, romper o pellet celular com gentle tocando, e adicionar 3 ml de fixador fresco.
  12. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante. Quebra-se o pellet celular com toque suave, e adicionar fresco 3 ml de fixador.
  13. Repita o passo 3.12 mais duas vezes.
  14. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Em seguida, adicione 400 a 600 mL fixador e misturar completamente com pipetagem.
  15. Queda de 30 mL células fixadas em lâminas pré-limpas e molhadas inclinado em um ângulo de 45 ° e permitir que as lâminas para o ar seco completamente durante a noite.

4. mouse pintura cromossômica por mFISH

  1. A desnaturação cromossomo
    1. Colocar a lâmina contendo diferenciais de células em metafase 2x SSC durante 2 minutos à temperatura ambiente.
    2. Desidratar a corrediça por lavagem etanol série durante 2 minutos cada em 70%, 80%, e 100%. Incubar durante 60 minutos a 65 ° C.
    3. Pré-aqueça solução de desnaturação de 40 mL (70% de formamida / 2x SSC; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) num frasco Coplin vidro durante 30 min. Desnaturar cromossomos incubando o slide na solução de desnaturação pré-aquecido para 1-1,5 min.
    4. Extingue-se deslizar imediatamente em gelo-etanol frio a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação. Em seguida, desidrata por lavagem com etanol a 80% durante 2 min. Repetir a lavagem de etanol com 100% de etanol por 2 min. Completamente secar o slide à temperatura ambiente.
  2. Desnaturação e Hibridação da sonda Mistura
    1. Resumidamente, centrifugar a mistura de sonda fornecido pelo fabricante, transferir 10 ul de mistura de sonda para um encaixe 500 uL tampão tubo de centrífuga, e desnaturadas por incubação a 80 ° C (± 2 ° C) em banho de água durante 7 minutos.
    2. Colocar o tubo de centrifugação com a mistura de sonda num banho de água a 37 ° C durante 10 min.
    3. Aplique a mistura sonda desnaturada para o slide com chromoso desnaturadomes.
    4. cobrir cuidadosamente a área com um x 18 mm lamela de vidro 18 mm e eliminar as bolhas de ar visíveis, pressionando muito suavemente a lamínula a deslizar. Selar todos os quatro lados da lamela de cobertura com cimento de borracha e incubar durante 12 h a 16 h no escuro a 37 ° C numa câmara humidificada para hibridação.
  3. Pós Hibridização de lavar roupa e Detecção
    1. Retire cuidadosamente o cimento de borracha ea lamela.
    2. Colocar a lâmina em SSC 0,4x pré-aquecido a 74 ° C (± 2 ° C) durante 5 min.
    3. Lavar corrediça na solução de lavagem II (4x SSC / 0,1% de Tween-20) durante 2 min.
    4. Coloque 20 mL de anti-fade meio de montagem com DAPI contracoloração (1,5 mg / mL) e cobrir com uma lamela de vidro. Pressione suavemente lamela com o tecido laboratório para remover as bolhas de ar e solução de montagem excesso. Selar as bordas da lamela com unha polonês.
    5. Visualização de slides usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros adequados.

5. Spectral Cariotipagem (SKY) do mouse Cromossomos

  1. Cromossomos e Probe desnaturação
    1. Equilibrar corrediça em 2x SSC à temperatura ambiente durante 2 minutos, sem agitação.
    2. Desidratar diapositivos numa série de etanol (70%, 80%, e 100% de etanol) durante 2 minutos cada, à temperatura ambiente. Ar seco a corrediça para remover o etanol completamente.
    3. solução quente de 40 ml de desnaturação (70% formamida / 2x SSC; pH 7,0) em um frasco Coplin vidro durante 30 min.
    4. Incubar corrediça na solução de desnaturação pré-aquecido durante 1 a 1,5 minutos.
    5. mergulhar imediatamente a deslizar para gelada etanol a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação.
    6. Desidratar a corrediça, colocando-o em etanol a 80% durante 2 min e em seguida em etanol a 100% durante 2 min à temperatura ambiente.
    7. Desnaturar a sonda CÉU (frasco n ° 1 fornecido pelo fabricante) num banho de água regulado para 80 ° C (± 2 ° C)durante 7 minutos, e, em seguida, colocar imediatamente em um banho de água diferente definido como 37 ° C durante 10 min.
  2. sonda de hibridação
    1. Adicionar 10 ul de sonda desnaturada CÉU para os cromossomas desnaturadas.
    2. Com cuidado, coloque um x 18 mm lamela de vidro 18 mm sobre a sonda SKY modo que não há bolhas de ar presas sob a lamela.
    3. Selar as bordas da lamela com cimento de borracha.
    4. Colocar a lâmina numa câmara humidificada à prova de luz e incubar no escuro a 37 ° C durante 24 h a 36 h.
  3. Lavagem pós-hibridação e detecção de fluorescência
    1. Remover o cimento de borracha com muito cuidado, sem perturbar a lamela.
    2. Colocar a lâmina em pré-aquecido a solução de lavagem rápida (SSC 0,4x) a 72 ° C (± 2 ° C) durante 5 min com agitação constante. Imergir corrediça em solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar durante 1 minuto, agitando.
    3. Opcional: adicionar 80 ul de reagente de bloqueio(Frasco n ° 2 fornecido pelo fabricante) para a área de hibridação, coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se no escuro a 37 ° C durante 30 minutos numa câmara humidificada.
    4. Suavemente remover a lamela de plástico e lava-se a corrediça com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III durante 5 min.
    5. Aplicar 80? L de reagente de coloração com Cy5 (frasco n ° 3 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada.
    6. Dip slide num frasco Coplin contendo vidro pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar a 45 ° C num banho de água durante 2 min com agitação. Repita este passo de lavagem 3 vezes.
    7. Aplicar 80? L de reagente de coloração Cy5.5 (frasco n ° 4 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada.
    8. Lave o slide 3 vezes com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III.
    9. Segure o slide em uma posição inclinada contra uma toalha de papel para drenar o excesso de líquido. Adicionar 20 ul anti-fade reagente DAPI (frasco # 5 fornecido pelo fabricante) e coloque cuidadosamente um x 60 milímetros lamela de vidro 24 mm sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Selar as bordas da lamela com unha polonês e observar com um microscópio de epifluorescência equipado para capturar imagens do céu.

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Resultados

irradiação total do corpo induz inúmeras aberrações cromossómicas em células da medula óssea de ratos irradiados. O actual protocolo foi optimizado para a paragem da mitose in vivo de células de medula óssea após a exposição à radiação, a colheita de células de medula óssea a partir das patas traseiras de ratos irradiados, o isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade, a preparação dos diferenciais de c?...

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Discussão

Vários passos críticos determinar o sucesso de mFISH e SKY. O primeiro e mais importante passo é para optimizar o tratamento com colchicina para paragem da mitose in vivo das células mononucleares de medula óssea. A concentração de colchicina e tempo de tratamento individual ou em concertação determinar o índice mitótico, bem como de cromossomos de condensação de dois pré-requisitos importantes para a pintura cromossomo eficaz. Uma alta concentração de colchicina ou um tempo mais longo de tratam...

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Divulgações

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por Arkansas Espaço Grant Consortium e do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais biomédica através de National Aeronautics and Space Administration, concede NNX15AK32A (RP) e RE03701 (MH-J), e P20 GM109005 (MH-J), e da Administração de Veteranos dos EUA ( MH-J). Agradecemos a Christopher Fettes, Coordenador do Programa para o Departamento de Saúde Ambiental e Ocupacional da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas, pela assistência editorial na preparação do manuscrito.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
FormamideSigma-Aldrich221198-100ML
SSC Buffer 20× ConcentrateSigma-AldrichS6639-1L
SKY Laboratory Reagent for MouseApplied Spectral ImagingFPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection KitApplied Spectral ImagingFPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
Glass coverslipsFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw CapFisher Scientific08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution Life Technologies10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Colcemid powderFisher Scientific50-464-757 
Histopaque-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiatorJ. L. Shepherd & AssociatesModel 484B
Syringe 1 mLBD Biosciences647911
Ethyl Alcohol, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and MagnesiumFisher ScientificICN1860454
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10-437-010
MethanolFisher ScientificA454SK-4
Glacial acetic acidFisher ScientificAC295320010
Zeiss MicroscopeZeissAXIO Imager.Z2

Referências

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