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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Résumé

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Introduction

The two most reliable methods of identifying radiation-induced inter-chromosomal stable aberrations are multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH), which allows the painting of two or more chromosomes simultaneously, and spectral karyotyping (SKY), which imparts a distinct color to each homologous chromosome pair in the genome. Unlike unstable aberrations, stable aberrations are persistent in nature and may be propagated for several generations in irradiated populations1, and are regarded as critical molecular "signatures" of radiation-induced cytogenetic lesions2. Studies by various groups have shown that stable aberrations are associated with the pathogenesis and development of a number of diseases, including cancer3. Before the era of chromosome painting (also referred as molecular cytogenetics), the conventional G-banding technique was the only method for detecting stable chromosomal aberrations. However, chromosome banding is a challenge to cytogeneticists because the resolution is limited, reproducibility is uncertain, it is a labor-intensive procedure, and it requires highly skilled and experienced cytogeneticists for reliable data interpretation4. Moreover, the classic banding technique does not allow detection of complex chromosomal rearrangements, which involve the interaction of three or more breaks distributed among two or more chromosomes, a common outcome of radiation damage. Complex aberrations may persist in individuals many years after radiation exposure, making them useful for retrospective biodosimetry5. Therefore, an alternate approach was required to overcome the limitations of conventional banding techniques to detect stable chromosomal rearrangements.

In the late 1960s, the pioneering work of Gall and Pardue (1969) on molecular hybridization using nucleic acid probes labeled with radioactive material commenced a new era in the field of cytogenetics, which allowed detection of a specific DNA sequence on chromosomes6. However, the use of radioactive probes for molecular hybridization had several drawbacks: radioactive probes are relatively unstable, probe activity depends on radioactive decay of the isotope used, hybridization takes a longer time, the resolution is limited, the probes are relatively costly, and the radioactive materials are a health hazardous. Thus, it became necessary to develop and design non-radioactive probes. The introduction of fluorescent tagged nucleic acid probes in the 1980s and 1990s overcame the limitations of radioactive probes and greatly enhanced the safety, sensitivity, and specificity of the hybridization technique7-10. Fluorescent probes give rise to extremely bright signals when observed under fluorescence microscopes equipped with the appropriate excitation and emission filters. Any loss, gain, or rearrangement of fluorescent labeled chromosome/s or a part of the chromosome is easily identifiable with this FISH technique.

Analysis of chromosomal aberrations by FISH painting has led to marked progress in cytogenetic research over the years. Designing fluorescent labeled probes for specific applications ranging from locus-specific probes to whole-chromosome painting probes has advanced the field significantly; this has also facilitated the detection of submicroscopic ("cryptic") rearrangement, which was not possible by conventional chromosome banding. Chromosome painting by mFISH and SKY have proven to be valuable tools for the identification of simple and complex inter-chromosomal rearrangements. The basic principles for both techniques are similar, but the method of detection and discrimination of fluorescent signal after in situ hybridization and the process of image acquisition are different. In mFISH, separate images of each of the four fluorochromes are captured by using narrow bandpass microscope filters; dedicated software is then used to combine the images. While in SKY, image acquirement is based on a combination of epifluorescence microscopy, charge-coupled device imaging, and Fourier spectroscopy, which allows the measurement of the entire emission spectrum with a single exposure at all image points. In both mFISH and SKY, monochrome images are captured independently, then merged, and finally, unique pseudo-colors are assigned to the chromosomes in monochromatic images based on the specific dye attached to each fluorochrome probe.

The contribution of mFISH and SKY analysis in the radiation biology field is remarkable, particularly for retrospective dose estimation of human exposure to IR (radiation biodosimetry)11-14, radiation carcinogenesis risk assessment15, as well as detection and risk estimation of radiotherapy-related secondary cancer16. A recent study on mice has shown that a FISH-based chromosome painting technique is also an important tool for evaluating the efficacy of radiation countermeasure17. In the present study, the effect of total body radiation exposure on the induction of stable chromosomal aberrations in the bone marrow cells of mice has been demonstrated using mFISH and SKY techniques.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole animal a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales. Tous les animaux ont été logés dans l'animalerie climatisée standard à 20 ± 2 ° C avec 10 - 15 cycles horaires de l'air frais et l'accès libre à la nourriture standard pour rongeurs et de l'eau. À l'arrivée, les souris ont été mis en quarantaine pendant 1 semaine et à condition de rongeur certifié chow.

1.Radiation exposition et in vivo Arrestation de cellules métaphase

  1. souris Exposer non anesthésié à 2 Gy rayonnement du corps entier dans une chambre d'irradiation. Pendant l'irradiation, placer la souris dans une chambre de maintien bien ventilé pour assurer qu'ils ne se déplacent pas librement et reçoivent une dose uniforme.
  2. Injecter 100 ul de solution à 0,05% de colchicine (cpoudre olchicine dissous en calcium et en magnésium libre PBS) par voie intrapéritonéale en utilisant une aiguille 25 G attaché avec 1 ml seringue jetable. Éviter l'injection directement dans un organe quelconque.
  3. Laisser l'animal dans la cage pendant 2 h avant la récolte des cellules de moelle osseuse. Observez l'animal pour tout signe de douleur ou de détresse.

2. moelle osseuse de cellules Récolte et isolement de cellules de moelle osseuse mononucléaires par gradient de densité Centrifugation

  1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO2.
  2. Vaporiser éthanol à 70% sur la dorsale et la face ventrale.
  3. Faire une incision de 2 cm sur la peau abdominale avec des ciseaux pointus. Attrapez la peau de chaque côté de l'incision avec des pinces émoussées et tirez doucement ouvrir les muscles abdominaux.
  4. Coupez les deux pattes de derrière avec des ciseaux et les placer immédiatement dans le pré-réfrigéré PBS avec 4% de FBS.
  5. Nettoyer soigneusement tous les muscles attachés à la patte arrière avec une lame de rasoir et de la gaze de coton bandage pointu.
  6. Séparer le tibia du fémur. Coupez les deux extrémités de chaque os avec une lame de rasoir.
  7. Vider le contenu de la moelle osseuse avec 3 ml de PBS (avec 4% de FBS) à l'aide d'une aiguille 23 G attachée à une seringue de 3 ml et de recueillir le contenu dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Faire passer la suspension de cellules au moins 10 fois à travers l'aiguille pour faire une suspension de cellules isolées.
  8. superposer soigneusement la suspension cellulaire sur un volume égal de milieu de séparation de lymphocytes (3 mL), sans perturber l'interface entre la suspension cellulaire et du milieu de séparation des lymphocytes. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante.
  9. Recueillir soigneusement la couche leucocytaire sans déranger les autres couches et le transfert dans un nouveau tube de 15 ml centrifugeuse.

3. Préparation de métaphase Spreads cellulaires

  1. Ajouter 10 ml de PBS dans le tube contenant la couche leucocytaire.
  2. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  3. Retirez délicatement le surnageant. Puis briser til culot cellulaire avec tapotant doucement et ajouter 10 ml de PBS.
  4. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire, briser le culot, et ajouter 4 ml de pré-chauffé hypotonique solution de chlorure de 0,075 M de potassium. Ajouter hypotonique goutte de solution à goutte avec une agitation constante douce.
  6. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
  7. Après traitement hypotonique, ajouter un volume égal (4 ml) de fixateur (méthanol: acide acétique glacial, 3: 1 v / v) dans le tube de 15 ml et mélanger doucement en inversant le tube.
  8. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant.
  9. Brisez le culot cellulaire avec taraudage suivi par vortex doux pendant quelques secondes et ajouter 3 ml de goutte de solution fixatif à goutte avec une agitation constante.
  10. Incuber pendant 30 min à température ambiante, puis centrifuger à 400 g pendant 5 min.
  11. Retirer le surnageant, briser le culot cellulaire avec gentle taraudage, et ajoutez 3 mL fixateur frais.
  12. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant. Brisez le culot cellulaire avec tapotant doucement et ajouter 3 mL frais fixateur.
  13. Répétez l'étape 3.12 deux fois de plus.
  14. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Puis ajouter 400 à 600 pi fixateur et bien mélanger avec pipetage.
  15. Déposer 30 ul des cellules fixées sur des lames pré-nettoyés et humides inclinés à un angle de 45 ° et laisser les lames sécher à l'air complètement du jour au lendemain.

4. Souris Chromosome Peinture par mFISH

  1. chromosome dénaturation
    1. Placez la diapositive contenant les écarts de cellules métaphase dans 2x SSC pendant 2 min à température ambiante.
    2. Déshydrater le coulisseau par lavage en série d'éthanol pendant 2 minutes chacune dans 70%, 80% et 100%. Incuber pendant 60 min à 65 ° C.
    3. Préchauffer la solution de dénaturation à 40 mL (70% de formamide / 2x SSC; pH 7,0) à 70 ° C (± 2 ° C) dans un bocal de Coplin en verre pendant 30 min. Dénaturer chromosomes en incubant la diapositive dans une solution de dénaturation préchauffé pendant 1 à 1,5 min.
    4. Quench glisser immédiatement dans de la glace-froid à 70% d'éthanol pendant 2 min pour arrêter le processus de dénaturation ainsi que pour prévenir les chromosomes dénaturés de re-recuit. Déshydrater alors par lavage à l'éthanol à 80% pendant 2 min. Répétez le lavage à l'éthanol avec 100% d'éthanol pendant 2 min. Complètement sécher la lame à la température ambiante.
  2. Dénaturation et Hybridation de la sonde Mélange
    1. Centrifuger brièvement le mélange de sonde fournie par le fabricant, transférer 10 pi de mélange de la sonde dans un 500 pi enfichable tube de centrifugeuse à bouchon, et dénaturés par incubation à 80 ° C (± 2 ° C) dans un bain d'eau pendant 7 min.
    2. Placer le tube de centrifugeuse avec le mélange de sonde dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min.
    3. Appliquer le mélange de sonde dénaturée sur la lame avec chromoso dénaturémes.
    4. couvrir soigneusement la zone avec un 18 mm x 18 mm couvercle en verre de glissement et d'éliminer les bulles d'air visibles en appuyant très doucement la lamelle à glisser. Sceller les quatre côtés de la lamelle avec du ciment en caoutchouc et incuber pendant 12 h à 16 h dans l'obscurité à 37 ° C dans une chambre humidifiée pour l'hybridation.
  3. Poster Hybridation laver et détection
    1. Retirez délicatement le ciment de caoutchouc et la lamelle.
    2. Placer la lame dans préchauffée 0,4x SSC à 74 ° C (± 2 ° C) pendant 5 min.
    3. Laver la lame dans une solution de lavage II (4x SSC / 0,1% de Tween 20) pendant 2 min.
    4. Placer 20 ul d'anti-fade milieu de montage avec DAPI de contraste (1,5 pg / ml) et couvrir avec une lamelle de verre. Appuyez doucement sur la lamelle avec le tissu de laboratoire pour éliminer les bulles d'air et de la solution de montage en excès. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles.
    5. Voir diapositives à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés.

5. Spectral caryotype (SKY) de Chromosomes souris

  1. Chromosome et Probe Dénaturation
    1. Equilibrer diapositive dans 2x SSC à température ambiante pendant 2 minutes, sans agitation.
    2. Déshydrater coulissent dans une série d'éthanol (70%, 80% et 100% d'éthanol) pendant 2 minutes à chaque fois à la température ambiante. Air-sécher la lame pour éliminer l'éthanol complètement.
    3. Chauffer la solution 40 ml de dénaturation (70% de formamide / 2 x SSC; pH 7,0) dans un bocal de Coplin en verre pendant 30 min.
    4. Incuber slide en solution de dénaturation pré-chauffé pour 1 à 1,5 min.
    5. immerger immédiatement la lame dans la glace froide éthanol à 70% pendant 2 min pour arrêter le processus de dénaturation ainsi que pour prévenir les chromosomes dénaturés de re-recuit.
    6. Déshydrater la lame en le plaçant dans 80% d'éthanol pendant 2 minutes, puis dans l'éthanol à 100% pendant 2 min à température ambiante.
    7. Dénaturer la sonde SKY (flacon n ° 1 fourni par le fabricant) dans un bain d'eau réglé à 80 ° C (± 2 ° C)pendant 7 min, puis placer immédiatement dans un bain d'eau différente réglé à 37 ° C pendant 10 min.
  2. sonde hybridation
    1. Ajouter 10 pi de sonde de SKY dénaturée sur les chromosomes dénaturés.
    2. Placez délicatement un 18 mm x 18 mm lamelle de verre sur la sonde de SKY sorte que les bulles d'air sont piégés sous la lamelle.
    3. Sceller les bords de la lamelle couvre-objet avec du ciment de caoutchouc.
    4. Placer la lame dans une chambre étanche à la lumière humidifié et incuber dans l'obscurité à 37 ° C pendant 24 h à 36 h.
  3. Post-hybridation de lavage et de détection Fluorescence
    1. Retirer la colle de caoutchouc très soigneusement sans perturber la lamelle.
    2. Placer la lame dans préchauffée solution de lavage rapide (0.4x SSC) à 72 ° C (± 2 ° C) pendant 5 min avec une agitation constante. Immergez glisser dans la solution de lavage III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) et incuber pendant 1 min en agitant.
    3. Facultatif: Ajouter 80 pi de réactif de blocage(Flacon n ° 2 fourni par le fabricant) sur la zone d'hybridation, placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber dans l'obscurité à 37 ° C pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée.
    4. Retirez délicatement la lamelle en plastique et laver la lame avec préchauffé (45 ° C) une solution de lavage III pendant 5 min.
    5. Appliquer 80 pi de réactif de coloration Cy5 (flacon n ° 3 fourni par le fabricant), placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 40 minutes dans une chambre humidifiée.
    6. Plonger la lame dans un bocal de Coplin en verre contenant préchauffé (45 ° C) solution de lavage III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) et incuber à 45 ° C dans un bain d'eau pendant 2 min avec agitation. Répéter cette opération de lavage 3 fois.
    7. Appliquer 80 pi de réactif de coloration Cy5.5 (flacon n ° 4 fourni par le fabricant), placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 40 minutes dans une chambre humidifiée.
    8. Laver la lame 3 fois avec préchauffé (45 ºC) solution de lavage III.
    9. Maintenez la lame dans une position inclinée contre une serviette en papier pour drainer l'excès de liquide. Ajouter 20 ul anti-fade réactif DAPI (flacon n ° 5 fourni par le fabricant) et placer soigneusement un 24 mm x 60 mm lamelle de verre sans introduire de bulles d'air. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles et d'observer avec un microscope à épifluorescence équipé pour capturer des images SKY.

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Résultats

irradiation totale du corps induit de nombreuses aberrations chromosomiques dans les cellules de moelle osseuse de souris irradiées. Le protocole actuel est optimisé pour in vivo arrêt de la mitose des cellules de la moelle osseuse après une exposition à un rayonnement, la récolte des cellules de moelle osseuse à partir des pattes postérieures de souris irradiées, l' isolement des cellules mononucléées de la moelle osseuse par gradient de densité de centrifugatio...

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Discussion

Plusieurs étapes essentielles déterminent le succès de mFISH et SKY. La première et la plus importante étape consiste à optimiser le traitement à la colchicine pour in vivo arrêt de la mitose des cellules mononucléaires de moelle osseuse. La concentration et le traitement colchicine temps individuellement ou de concert déterminer l'index mitotique, ainsi que la condensation des chromosomes, deux conditions préalables importantes pour la peinture chromosomique efficace. Une concentration élevée ...

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Déclarations de divulgation

The authors declare that they have no competing financial interests.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par l'Arkansas Espace Grant Consortium et de l'Institut national de recherche spatiale biomédicale par la National Aeronautics and Space Administration, accorde NNX15AK32A (RP) et RE03701 (MH-J), et P20 GM109005 (MH-J), et le US Veterans Administration ( MH-J). Nous remercions Christopher Fettes, coordonnateur du programme pour le ministère de l'environnement et de la santé au travail à l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales, l'assistance éditoriale en préparation du manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
FormamideSigma-Aldrich221198-100ML
SSC Buffer 20× ConcentrateSigma-AldrichS6639-1L
SKY Laboratory Reagent for MouseApplied Spectral ImagingFPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection KitApplied Spectral ImagingFPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
Glass coverslipsFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw CapFisher Scientific08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution Life Technologies10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Colcemid powderFisher Scientific50-464-757 
Histopaque-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiatorJ. L. Shepherd & AssociatesModel 484B
Syringe 1 mLBD Biosciences647911
Ethyl Alcohol, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and MagnesiumFisher ScientificICN1860454
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10-437-010
MethanolFisher ScientificA454SK-4
Glacial acetic acidFisher ScientificAC295320010
Zeiss MicroscopeZeissAXIO Imager.Z2

Références

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