3D-zellgedruckter hypoxischer Krebs-on-a-Chip zur Rekapitulation des pathologischen Verlaufs von solidem Krebs

Zusammenfassung

Hypoxie ist ein Kennzeichen der Tumormikroumgebung und spielt eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten des Krebses. Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess eines hypoxischen Krebs-auf-einem-Chip basierend auf der 3D-Zelldrucktechnologie, um eine hypoxiebedingte Pathologie von Krebs zu rekapitulieren.

Zusammenfassung

Die Mikroumgebung von Krebs hat einen signifikanten Einfluss auf das Fortschreiten der Krankheit. Insbesondere Hypoxie ist der Schlüsselfaktor für das Überleben, die Invasion und die Chemoresistenz von Krebs. Obwohl mehrere In-vitro-Modelle entwickelt wurden, um die hypoxiebedingte Krebspathologie zu untersuchen, wurde das komplexe Zusammenspiel der in vivo beobachteten Krebsmikroumgebung aufgrund des Mangels an präziser räumlicher Kontrolle noch nicht reproduziert. Stattdessen wurden 3D-Biofabrikationsansätze vorgeschlagen, um mikrophysiologische Systeme für eine bessere Nachbildung der Krebsökologie und eine genaue Bewertung der Krebsbehandlung zu schaffen. Hier schlagen wir einen 3D-Zelldruckansatz vor, um einen hypoxischen Krebs-auf-einem-Chip herzustellen. Die Hypoxie-induzierenden Komponenten im Chip wurden auf Basis einer Computersimulation der Sauerstoffverteilung bestimmt. Krebs-Stroma-Konzentrische Ringe wurden mit Biotinten gedruckt, die Glioblastomzellen und Endothelzellen enthielten, um eine Art von solidem Krebs zu rekapitulieren. Der resultierende Chip realisierte zentrale Hypoxie und verschlimmerte maligne bei Krebs mit der Bildung repräsentativer pathophysiologischer Marker. Insgesamt wird erwartet, dass der vorgeschlagene Ansatz zur Schaffung eines solid-krebsmimetischen mikrophysiologischen Systems die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Modellen für die Krebsforschung schließen wird.

Einleitung

Die Mikroumgebung von Krebs ist ein kritischer Faktor, der das Fortschreiten des Krebses antreibt. Mehrere Komponenten, einschließlich biochemischer, biophysikalischer und zellulärer Hinweise, bestimmen die pathologischen Merkmale von Krebs. Unter diesen ist Hypoxie stark mit krebserhaltendem Überleben, Proliferation und Invasion verbunden¹. Durch das unbegrenzte Wachstum und die Teilung von Krebszellen werden Nährstoffe und Sauerstoff kontinuierlich erschöpft und es entsteht ein hypoxischer Gradient. Unter sauerstoffarmen Bedingungen aktivieren Zellen eine mit Hypoxie induzierbare Transkriptionsfaktor (HIF) assoziierte molekulare Kaskade. Dies....

Protokoll

1. Computersimulation der Sauerstoffgradientenbildung

1. Erstellung eines 3D-Geometriemodells für den hypoxischen Krebs-on-a-Chip-Druck
   1. Führen Sie eine 3D-CAD-Software aus.
   2. Skizzieren Sie das Geometriemodell von hypoxischem Krebs auf einem Chip. Klicken Sie auf Skizze und wählen Sie die gewünschte Ebene aus, um die Geometrie zu zeichnen. Die Detailskala der einzelnen Teile finden Sie in der Zeichnung (Abbildung 2A).
   3. Legen Sie die Dicke der Geometrie fest, indem Sie auf Feature-Protrusion Boss/Baseklicken. Geben Sie die gewünschte Dicke (siehe

Ergebnisse

Der hypoxische Krebs-auf-einem-Chip wurde mit computergestützter 3D-Zelldrucktechnologie entwickelt, um Hypoxie und krebsbedingte Pathologie zu rekapitulieren (Abbildung 1). Sauerstofftransport und -verbrauch wurden mit dem 3D-Geometriemodell simuliert. Der Chip wurde in Form von konzentrischen Ringen entwickelt, um die radiale Sauerstoffdiffusion und -erschöpfung in Krebsgeweben nachzuahmen (Abbildung 2A). Nach der Definition .......

Diskussion

In dieser Studie beschreiben wir den Herstellungsprozess eines hypoxischen Krebs-auf-einem-Chips auf Basis der 3D-Zelldrucktechnologie. Die Bildung des hypoxischen Gradienten im entworfenen Chip wurde durch Computersimulationen vorhergesagt. Die Umgebung, die einen heterogenen hypoxischen Gradienten induzieren kann, wurde über eine einfache Strategie reproduziert, die die 3D-gedruckte gasdurchlässige Barriere und die Glasabdeckung kombiniert. Die hypoxiebedingten pathologischen Merkmale des Glioblastoms, einschließlic.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
Human umbilical vein endothelial cells	Promocell	C-12200
U-87 MG cells	ATCC	ATCC HTB-14
Disposable
0.2 μm syringe filter	Sartorius	16534-K
10 mL disposable syringe	Jung Rim	10ml 21G32
10 mL glass vial	Hubena	A0039
10 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	91010
15 mL conical tube	SPL lifescience	50015
18G plastic needle	Musashi engineering	PN-18G-B
20G plastic tapered dispense tip	Musashi engineering	TPND-20G-U
22x50 glass cover	MARIENFIELD	0101142
25 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	90125
3 mL disposable syringes	HENKE-JET	4020-X00V0
40 µm cell strainer	Falcon	352360
5 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	91005
50 mL conical tube	SPL lifescience	50050
50 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	90150
50N precision nozzle	Musashi engineering	HN-0.5ND
Aluminum foil	SINKWANG
Capillary tips	Gilson	CP1000
Cell-scrapper	SPL lifescience	90030
Confocal dish	SPL lifescience	200350
Parafilm	Bemis	PM996
Pre-coated histology slide	MATSUNAMI	MAS-11
Reservoir	SPL lifescience	23050
T-75 cell culture flask	SPL lifescience	70075
Equipment
3DX printer	T&R Biofab
Autoclave	JEIOTECH	AC-12
Centrifuger	Cyrozen	1580MGR
Confocal laser microscopy	Olympus Life Science	FV 1000
Fluorescence microscope	FISHER SCEINTIFIC	O221S366
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Hand tally counter	KTRIO
Hemocytometer	MARIENFIELD	0650030
Incubator	Panasonic	MCO-170AIC
Laminar flow cabinet	DAECHUNG SCIENCE	CB-BMMS C-001
Metal syringe	IWASHITA engineering	SUS BARREL 10CC
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Oven	JEIOTECH	OF-12, H070023
Positive displacement pipette	GILSON	NJ05652
Refrigerator	SAMSUNG	CRFD-1141
Voltex Mixer	DAIHAN scientific	VM-10
Water bath	DAIHAN SCIENTIFIC	WB-11
Water purifier	WASSER LAB	DI-GR
Materials
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072
10x PBS	Intron	IBS-BP007a
4% Paraformaldehyde	Biosesang
70% Ethanol	Daejung	4018-4410
Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
Anti-HIF-1 alpha antibody	Abcam	ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antibody	Abcam	ab88664
Anti-SOX2 antibody	Abcam	ab75485
Bovine Serum Albumin	Thermo scientific	J10857-22
Collagen from porcine skin	Dalim tissen	PC-001-1g
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher	D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2	Promocell	C22011
Fetal bovine serum	Gibco	12483-020
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Theromofisher	A-11001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Theromofisher	A-11012
High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)	Hyclone	SH30243-0
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	311413-100ML
Live/dead assay kit	Invitrogen	L3224
Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control	Abcam	ab170190
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Poly(ethylene-vinyl acetate)	Poly science	06108-500
Polydimethylsiloxane	Dowhitech	sylgard 184
Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control	Abcam	ab37415
Sodium hydroxide solution	Samchun	S0610
Triton X-100	Biosesang	TRI020-500-50
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a	COMSOL AB
IMS beamer			in-house software
SolidWorks Package	Dassault Systems SolidWorks Corporation