3D-клеточная печать гипоксического рака на чипе для рекапитуляции патологической прогрессии солидного рака

Резюме

Гипоксия является отличительной чертой микроокружения опухоли и играет решающую роль в прогрессировании рака. В этой статье описывается процесс изготовления гипоксического рака на чипе на основе технологии 3D-печати клеток для повторения патологии рака, связанной с гипоксией.

Аннотация

Рак микроокружения оказывает значительное влияние на прогрессирование заболевания. В частности, гипоксия является ключевым фактором выживания при раке, инвазии и хеморазистанции. Хотя для изучения патологии рака, связанной с гипоксией, было разработано несколько моделей in vitro, сложное взаимодействие микроокружения рака, наблюдаемое in vivo, еще не было воспроизведено из-за отсутствия точного пространственного контроля. Вместо этого были предложены подходы к 3D-биофабрикации для создания микрофизиологических систем для лучшей эмуляции экологии рака и точной оценки противоопухолевого лечения. Здесь мы предлагаем подход к 3D-клеточной печати для изготовления гипоксического рака на чипе. Вызывающие гипоксию компоненты в чипе были определены на основе компьютерного моделирования распределения кислорода. Концентрические кольца Рак-строма были напечатаны с использованием биолинь, содержащих клетки глиобластомы и эндотелиальные клетки, для рекапитуляции типа солидного рака. Полученный чип реализовал центральную гипоксию и усугубил злокачественность при раке с образованием репрезентативных патофизиологических маркеров. В целом, ожидается, что предлагаемый подход к созданию микрофизиологической системы с твердым раком и миметикой преодолеет разрыв между моделями in vivo и in vitro для исследований рака.

Введение

Микроокружение рака является критическим фактором, стимулирующим прогрессирование рака. Множественные компоненты, включая биохимические, биофизические и клеточные сигналы, определяют патологические особенности рака. Среди них гипоксия тесно связана с выживаемостью при раке, пролифрацией и инвазией^1. Из-за неограниченного роста и деления раковых клеток питательные вещества и кислород непрерывно истощаются, и генерируется гипоксический градиент. В условиях низкого содержания кислорода клетки активируют молекулярный каскад, связанный с гипоксией индуцируемым транскрипционным фактором (HIF). Этот процесс индуцирует некротическое ядро, запускает метаболические изменения и инициирует гиперплазию кровеносных сосудов и метастазирование^2,3. Впоследствии гипоксия в раковых клетках вызывает разрушение соседних нормальных тканей. Кроме того, гипоксия тесно связана с терапевтической устойчивостью солидных опухолей многофакторными способами. Гипоксия может сильно препятствовать лучевой терапии, так как радиочувствительность ограничена из-за активных форм кислорода^1,4. Кроме того, снижается уровень рН раковых микросред, что уменьшает накопление препарата^1. Поэтому воспроизведение патологических особенностей, связанных с гипоксией in vitro, является перспективной стратегией для научных и доклинических результатов.

Моделирование конкретной микросреды рака имеет важное значение для понимания развития рака и изучения соответствующих методов лечения. Хотя животные модели широко используются из-за их сильной физиологической значимости, существуют вопросы, связанные с видовых различиями и этическими проблемами^5. Кроме того, хотя обычные 2D- и 3D-модели позволяют манипулировать раковыми клетками в режиме реального времени для углубленного анализа, их архитектурная и клеточная сложность не может быть полностью повторена. Например, модели раковых сфероидов широко используются, так как агрегация раковых клеток в сфероиде может естественным образом генерировать гипоксию в ядре. Кроме того, большое количество клеточных сфероидов однородного размера было получено с использованием многоязычных систем^{6, 7}на^основепластика или силикона. Однако более низкая гибкость в отношении захвата точной гетерогенной структуры раковых тканей с помощью обычных платформ потребовала создания передовой технологии биофабрикации для создания высокобиомиметической платформы для улучшения исследований рака^8.

3D микрофизиологические системы (MPS) являются полезными инструментами для рекапитуляции сложной геометрии и патологического прогрессирования раковых клеток^9. Поскольку раковые клетки ощущают биохимический градиент факторов роста и хемокиных веществ и механическую гетерогенность, воспроизводимую в системе, важные особенности развития рака могут быть исследованы in vitro. Например, жизнеспособность рака, метастатическая злокачественность и лекарственная устойчивость в зависимости от изменяющихся концентраций кислорода были изучены с использованием MPSs^10,11. Несмотря на последние достижения, создание гипоксических состояний моделей in vitro зависит от сложных процедур изготовления, включая соединение с физическими газовыми насосами. Поэтому необходимы простые и гибкие методы построения специфических для рака микросред.

Технология 3D-печати клеток привлекла значительное внимание из-за ее точного контроля пространственного расположения биоматериалов для рекапитуляции нативных биологических архитектур^12. В частности, эта технология преодолевает существующие ограничения моделей 3D-гипоксии благодаря своей высокой управляемости и возможности построения пространственных особенностей микроокружения рака. 3D-печать также облегчает автоматизированное производство с помощью послойного процесса, тем самым обеспечивая быстрое, точное и воспроизводимое построение сложных геометрий для имитации фактических архитектур тканей. В дополнение к преимуществам существующих стратегий производства 3D MPS, патофизиологические особенности прогрессирования рака могут быть воспроизведены путем паттернов биохимических, клеточных и биофизических компонентов^13,14.

Здесь мы представляем стратегию 3D-печати клеток для гипоксического рака на чипе для рекапитуляции гетерогенности твердого рака(рисунок 1)^15. Параметры изготовления были определены с помощью вычислительного моделирования образования центральной гипоксии в системе. Концентрические кольца Рака-Стромы были напечатаны с использованием коллагеновых биоинков, содержащих клетки глиобластомы и эндотелиальные клетки, чтобы имитировать патофизиологию глиобластомы, типа солидного рака. Образование радиального градиента кислорода усугубляет злокачественность рака, что свидетельствует об усилении агрессивности. Кроме того, мы указываем будущие перспективы применения чипа к доклиническим моделям, специфичным для пациента. Ожидается, что предлагаемый подход к созданию твердой миметической микрофизиологической системы рака преодолеет разрыв между моделями рака in vivo и in vitro.

протокол

1. Компьютерное моделирование образования градиента кислорода

1. Генерация 3D-геометрической модели для гипоксической печати рака на чипе
   1. Запустите программное обеспечение 3D CAD.
   2. Набросок геометрической модели гипоксического рака на чипе. Нажмите на Sketch и выберите нужную плоскость, чтобы нарисовать геометрию. Обратитесь к чертежу(рисунок 2A)для детального масштабирования каждой детали.
   3. Установите толщину геометрии, нажав на Feature-Protrusion Boss/Base. Введите желаемую толщину (см. рисунок 2A)в пустое поле и выберите зеленый значок галочки, чтобы сформировать 3D-геометрию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер рака на чипе определяется на основе желаемых объемов среды и гидрогеля. В настоящем эксперименте желаемые объемы среды и гидрогеля составляли приблизительно 1 500 мкл и 500 мкл соответственно, исходя из предыдущего практического опыта разрешения биопринтера на основе экструзии.
   4. Сохраните файл геометрии в формате 3D CAD (.prt или .stl).
2. Определение клеточной плотности для индукции гипоксического ядра
   1. Запустите программу моделирования физической диффузии.
   2. Нажмите на LiveLink и выберите используемую программу САПР. Нажмите «Синхронизировать», чтобы импортировать геометрию гипоксического рака на чипе в программе моделирования. Поскольку внутреннее пространство камеры будет заполнено питательной средой в реальных экспериментальных условиях, кислород будет диффундировать через внутреннее пространство камеры и клеточную конструкцию, которая будет состоять из нагруженных клетками гидрогелей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущему исследованию для получения подробной информации о физических параметрах¹⁵.
   3. Определите импортированную 3D-геометрию как контрольный объем пространства, в котором кислород диффундирует, а клетки потребляют кислород(рисунок 2B).
   4. Запустите компьютерный анализ для газодиффузионного анализа в соответствии с руководством пользователя и ранее установленными методами^16,17.
   5. Из результатов компьютерного анализа экспортируйте данные о расчетной концентрации кислорода по поперечному сечению A-A' в каждый момент времени, следуя руководству пользователя. Управляющее уравнение основано на первом законе Фика, выраженном в Eq. (1)(Рисунок 2C).
      
      где c — концентрация, D — коэффициент диффузии кислорода, _{N-клетка} — плотность клеток, — максимальная скорость поступления кислорода, а Km — постоянная Михаэлиса-Ментена. Константы применялись так, как описано в предыдущей публикации^15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая точка времени означает пошаговую точку для наблюдения за изменением диффузии кислорода с течением времени.
   6. Оцените, достигает ли минимальный уровень кислорода порога гипоксии и повторите процесс компьютерного анализа с увеличением или снижением плотности клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите, что градиент гипоксии образуется в конструкции, если уровень кислорода 80% в области гидрогеля составляет менее 0,02 мМ через 24 ч.
   7. Подтвердите количество клеток, необходимых для генерации градиента кислорода, индуцируя гипоксию в центральной области, из первого закона Фика на шаге 1.2.5 и результатов моделирования из шага 1.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе номер ячейки составлял 2 × 10⁶ ячеек / каждая конструкция.

2. Клеточная культура раковых клеток и стромальных клеток

1. Подготовка среды клеточной культуры во избежание физиологического стресса
   1. Для клеток U-87 MG (увековеченная клеточная линия глиобластомы человека) поместите 12 мл высокоуглекозаточной модифицированной среды Eagle от Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычий сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина в колбу для клеточной культуры T-75 в увлажненный инкубатор с температурой 37 ° C, 5% CO₂ в течение 30 минут, чтобы свести к минимуму тепловое и щелочное воздействие среды на клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глиобластома была выбрана в качестве типа солидного рака, потому что она имеет агрессивные характеристики в гипоксической среде. Другие различные виды рака могут быть применены к этой модели.
   2. Для эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVECs) поместите 12 мл среды роста эндотелиальных клеток в колбу для культуры клеток Т-75 в 5%_CO2 увлажненный инкубатор при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HUVEC были выбраны, потому что это одна из наиболее репрезентативных эндотелиальных клеточных линий. Различные типы стромальных клеток также могут быть применены к этой модели.
2. Быстрое оттаивание криоконсервных раковых клеток и стромальных клеток и их поддержание
   1. Переместите криовиалы, содержащие 5 x^{10 5} U-87 MG клеток и HUVEC, из контейнера с жидким азотом в ламинарную проточную тумба. Немедленно ослабьте и запрягьте колпачок, чтобы освободить внутреннее давление.
   2. Аккуратно поместите криоконсервированную клетку на водяную баню при 37 °C в течение 2 минут, не допуская крышку из воды. Промыть флаконы 70% этанолом под ламинарным потоком, чтобы предотвратить загрязнение.
   3. Переместите размороженные клетки в колбы, содержащие подготовленную питательную целлюлозу клеток, описанную на этапе 2.1, и поместите клеткосодержащие колбы в 5%_CO2 увлажненный инкубатор при 37 °C для восстановления клеток.
   4. Обновляйте питательные среды каждые 2 дня и поддерживайте рост клеток.
   5. После 24 ч оттаивания замените питательную целлюлозу клеток, чтобы избежать цитотоксичности диметилсульфоксида (ДМСО), который использовался для замораживания клеток. Используйте HUVEC, который прошел менее 6 проходов.

3. Приготовление коллагенового прегелевого раствора

1. Солюбилизация коллагеновой губки соляной кислотой (HCl) 0,1 Н
   1. Подготовьте раствор 0,1 Н HCl и процедить его шприцевым фильтром 0,2 мкм.
   2. Для 3 мл 1% (мас./об.) нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля готовят коллагеновые губки, нарезанные на 5 х 5 мм² штуки и весом 30 мг.
   3. Переложите нарезанные кусочки коллагена в стерильный стеклянный флакон 10 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте в 1,5 раза больше объема необходимого гидрогеля коллагена, учитывая потерю гидрогеля из-за липкой характеристики раствора коллагена.
   4. Добавьте 2,4 мл 0,1 N HCl в коллагенсодержащий стеклянный флакон и инкубирует его на коромысле при 15 об/мин и 4 °C в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем раствора 0,1 N HCl составлял четыре пятых от конечного объема требуемого гидрогеля коллагена. В этом случае было приготовлено 3 мл коллагена.
   5. После пищеварения просейте непереваренные частицы коллагена с помощью клеточного ситечкового фильтра 40 мкм. Храните кислый раствор коллагена при 4 °C и используйте в течение 7 дней.
2. Коррекция pH для 1% нейтрализованного раствора коллагена
   1. Центрифугировать кислый раствор коллагена при 1224 х г в течение 5 мин при 4 °C.
   2. Добавьте 30 мкл фенольных красных растворов в качестве показателя рН к конечной концентрации 1% (v/v) и 300 мкл 10x фосфат-буферного солевого (PBS) буфера до конечной концентрации 10% (v/v) в растворе коллагена прегеля.
   3. Нейтрализуют рН до 7 с помощью 1 N гидроксида натрия (NaOH), проверяя изменение цвета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из формулы, моли H⁺ = молярность H⁺ x объем H⁺ = моли OH^-= молярность OH^- x объем OH^-, добавьте 240 мкл NaOH.
   4. Добавьте дистиллированную воду для получения общего объема 3 мл.
   5. После корректировки pH храните 1% (мас./об.) нейтрализованный раствор коллагена при 4 °C и используйте в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предварительно проверить гелеобразование нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля, сделайте 50 мкл капель коллагена на небольшой посуде с использованием пипетки с положительным смещением и инкубировать их в инкубаторе 37 °C в течение 1 ч. Обратитесь к следующим трем методам для проверки перекрестной связи капель коллагена.
   6. Проверьте, изменился ли цвет коллагена на непрозрачный белый с прозрачного цвета.
   7. Наклоните контейнер и проверьте, прилип ли коллаген к дну контейнера.
   8. Налейте 1x PBS на капли и проверьте, не нарушена ли конструкция коллагена в растворе.

4.3D печать газопроницаемого барьера

1. 3D-печать жертвенной поли (этилен-винилацетатной) (PEVA) формы
   1. Сгенерируйте 3D-геометрию жертвенной формы PEVA, определенной на шаге 1, с помощью программного обеспечения 3D CAD(рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-геометрия и детальный масштаб модели, включая размеры, единицы измерения и типы линий, были показаны на рисунке 2A.
   2. Конвертируйте файл 3D CAD в формат STL, нажав на файл | Сохранить тип файла как STL. Кроме того, нажмите на опцию | Форма вывода в виде ASCII для генерации G-кода.
   3. Нажмите на файл | Откройте STL-файл и выберите сохраненный STL-файл, чтобы импортировать сгенерированный STL-файл. Нажмите на Модель Slice STL-CAD обменника, чтобы автоматически сгенерировать G-код жертвенной формы PEVA(рисунок 3B,C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Путь печати генерируется с соединением пересекающихся точек между фундаментальной фигурой STL-файла и плоскостью нарезки (т.е. слоем). По сути, фундаментальной фигурой фрагмента в STL-файле является треугольник, содержащий 3D-координаты. После получения пересекающихся точек между треугольником и слоем генерируется G-код для печати путем соединения каждой точки без перекрывающегося контура на слое^18. Любой алгоритм генерации G-кода на борту программного обеспечения может быть использован для создания путей печати для изготовления чипа.
   4. Подготовьте стерильный клей и гидрофильный гистологический слайд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофильное слайд-стекло имеет решающее значение для постоянного связывания полидиметилсилоксана (PDMS) на стекле и адгезии коллагеновых конструкций, инкапсулирующих раковые клетки и стромальные клетки.
   5. Печать жертвенной формы PEVA на слайде с помощью прецизионного сопла 50 G при пневматическом давлении 500 кПа при 110 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина линии зависит от скорости подачи, датчика сопла и температуры материала. Было использовано сопло 50 G и применена скорость подачи 400 для создания ширины линии 500 мкм для жертвенной стенки. Датчик сопла, пневматическое давление и скорость подачи определяются с практическими результатами^19. Жертвенная стенка должна быть достаточно толстой, чтобы удерживать раствор PDMS, что является следующим этапом изготовления.
2. Литье полидиметилсилоксана (PDMS) барьера
   1. Однородно смешайте 6 мл эластомера на основе PDMS и отверждающего агента 0,6 мл в течение 5 мин в пластиковом резервуаре. Это может изготовить 6 гипоксических раковых чипов, учитывая потерю из-за липкой характеристики PDMS.
   2. Загрузите смешанный раствор PDMS в одноразовый шприц объемом 10 мл и подойдите к шприцевой головке с пластиковым коническим наконечником дозирования 20 г.
   3. Наполните жертвенную форму PEVA смешанным раствором PDMS в шприце. Смешанный PDMS наполнит жертвенную форму PEVA выпуклой поверхностью. Высота барьера PDMS будет выше, чем у пресс-формы PEVA.
   4. Отверждите барьер PDMS в печи при 40 °C в течение более 36 ч, чтобы избежать плавления PEVA. Не повышайте температуру до более чем 88 °C, что является температурой плавления PEVA.
   5. Отсоедините жертвенную форму PEVA парой прецизионных пинцетов и стерилизуйте газопроницаемый барьер при 120 °C в автоклаве.

5. Получение инкапсулированных в клетки коллагеновых биоин

1. Отслоение подготовленных раковых клеток и стромальных клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая жизнеспособность клеток, весь процесс печати должен быть завершен как можно скорее после отсоединения ячеек.
   1. Промывайте раковые и стромальные клетки 10 мл 1x PBS с помощью серологической пипетки; лечить 2 мл 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с помощью пипетки и инкубировать их в течение 3 мин при 37 °C.
   2. Нейтрализовать трипсинизированные клетки 3 мл клеточной культуральной среды; собирать суспензии клеток в конические трубки по 15 мл и центрифугу при 516 х г в течение 5 мин при 20 °С.
   3. Аспирировать супернатант медленно; повторно суспендируют клеточные гранулы в 5 мл клеточной культуры и подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра.
   4. Переведите 5 x 10⁶ клеток каждого типа клеток в новые конические трубки по 15 мл и центрифугируют их при 516 x g в течение 5 мин при 20 °C.
   5. Аспирировать супернатант и поместить его на влажный лед.
2. Смешивание каждого типа клеток с 1% нейтрализованным раствором прегеля коллагена
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать термического затвердевания 1% нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля, этот процесс следует выполнять на влажном льду.
   1. Повторно суспендируют каждый тип клеточных гранул, собранных на этапе 5.1.4, с 20 мкл клеточной культуры каждая.
   2. Добавьте 1 мл 1% нейтрализованного раствора коллагена прегеля в каждую из повторно суспензионных клеток и перемешайте их однородно, используя пипетку с положительным смещением. Конечная концентрация каждого типа клеток составит 5 х 10⁶ клеток/мл.
   3. Переложите инкапсулированные коллагеновые биончасти в одноразовые шприцы объемом 3 мл с помощью положительной одноразовой пипетки и храните шприцы при 4 °C до 3D-печати клеток.

6.3D клеточная печать концентрических колец рак-строма

1. 3D-клеточная печать коллагеновых биосинов, инкапсулирующих раковые клетки и стромальные клетки
   1. Сгенерируйте 3D-геометрию концентрических колец рак-строма, определенных на шаге 1.2, с помощью программного обеспечения 3D CAD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры концентрических колец стромы рака определяются с помощью смоделированных параметров. Окончательные размеры параметров размеров показаны на рисунке 3A.
   2. Преобразуйте файл 3D CAD в формат файла STL и сгенерируйте G-код концентрических колец рак-строма с помощью обменника STL-CAD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к примечанию на шаге 4.1.2 для алгоритма генерации G-кода.
   3. Загрузите инкапсулированные в ячейки коллагеновые биоинки, содержащиеся в одноразовых шприцах по 3 мл, на головку 3D-принтера и установите температуру головки и пластины на 15 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если температура головки и пластины принтера достигает более 37 °C, биочернило становится сшитым и больше не печатается.
   4. Загрузите сгенерированный путь печати в управляющая программа 3D-принтера.
   5. Нажав на кнопку «Пуск», распечатайте коллагеновые биочернила, инкапсулирующие раковые клетки и стромальные клетки на газопроницаемом барьере после загруженного G-кода пластиковой иглой 18 г при пневматическом давлении около 20 кПа при 15 °C.
   6. В конце каждой операции печати вручную поместите стерилизованную стеклянную крышку 22 мм x 50 мм поверх газопроницаемого барьера для создания гипоксического градиента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните две группы в зависимости от наличия стеклянной крышки (GR+) и отсутствия (GR-) этой группы для проверки генерации гипоксического градиента.
   7. После генерации трех гипоксических раковых веществ на чипах перенесите чипы в инкубатор при 37 °C в течение 1 ч, чтобы сшивать коллагеновые биочернила.
2. Завершение процесса изготовления и обслуживания гипоксического рака на чипе
   1. После завершения всех процессов 3D-клеточной печати гипоксического рака на чипе аккуратно потрите покровные стекла поверх газопроницаемых барьеров с помощью скраппера для плотного склеивания(рисунок 4A,B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покровное стекло и газопроницаемый барьер собираются с помощью гидрофобного склеивания без химических клеев, просто соскребая склееную часть между защитным стеклом и барьером PDMS.
   2. Введите 1,5 мл среды роста эндотелиальных клеток в каждый чип. Чтобы избежать отслоения раковой конструкции, вводят питательную среду клеток с одной стороны чипа. Наклоните чип, чтобы позволить среде клеточного культуры течь с помощью пипетки.
   3. Обновляйте питательные среды каждый день в течение недели. Используйте пипетку для аспирации клеточной культуры; не используйте напорный насос.

7. Оценка жизнеспособности клеток после печати

1. Подготовка образцов и обработка кальцеином AM и раствором EthD-1
   1. Согрейте 1x PBS на водяной бане при 37 °C.
   2. Готовят пробирный раствор, добавляя 0,75 мкл кальциина ацетоксиметила (кальциин АМ) и 3 мкл гомодимера этидия (EthD-1) к 1,5 мл предварительно нагретого PBS.
   3. Осторожно аспирировать все носители из чипа с помощью пипетки.
   4. Промойте раковую конструкцию с помощью предварительного PBS. Заполните 1,5 мл PBS в чип с помощью пипетки и дайте ему постоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы избежать деформации конструкции рака, введите 1x PBS с одной стороны чипов и наклоните чипы, чтобы позволить 1x PBS течь.
   5. Аспирировать PBS из чипа; обработать раствор для анализа 1,5 мл и инкубировать чип при 37 °C в течение 20 мин, используя фольгу для защиты от света. Используйте пипетку для аспирации 1x PBS; не используйте всасывающий насос.
2. Визуализация жизнеспособности клеток с помощью флуоресцентного микроскопа
   1. Просмотр и захват меченых клеток с помощью флуоресцентного микроскопа(рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Calcein AM отмечает живые клетки с зеленой флуоресценцией (длина волны ~ 488 нм). EthD-1 представляет собой сигнал мертвых клеток с красной флуоресценцией (длина волны ~594 нм).
   2. Подсчитайте количество живых и мертвых клеток с помощью программного обеспечения для визуализации, программы обработки изображений с открытым исходным кодом и рассчитайте жизнеспособность с цифрами.

8. Иммунофлуоресценция для подтверждения образования центральной гипоксии и ее влияния на злокачественность рака

1. Фиксация, пермеабилизация и блокирование раковой конструкции
   1. Приготовьте 1x PBS, 4% параформальдегида (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 и 2% (мас./об.) бычий сывороточный альбумин (BSA) при комнатной температуре.
   2. Тщательно аспирировать все носители из чипа с помощью пипетки и промыть чип три раза с помощью 1x PBS. Чтобы избежать деформации конструкции рака, введите 1x PBS с одной стороны чипов и наклоните чипы, чтобы позволить 1x PBS течь. Между каждым этапом промывки дайте чипу постоять с 1x PBS в течение 5 минут, чтобы удалить остаточные растворы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x PBS был аспирирован с использованием пипетки, а не напорного насоса.
   3. Добавьте 500 мкл 4% PFA к раковой конструкции на чипе с помощью пипетки; оставьте его на 15 минут и промыть три раза 1x PBS, чтобы исправить клетки в раковой конструкции.
   4. Лечите раковую конструкцию 500 мкл 0,1% Triton X-100 с помощью пипетки при комнатной температуре в течение 5 мин и трижды промывайте 1x PBS для солюбилизации и пермеабилизации клеточной мембраны.
   5. Лечите раковую конструкцию 500 мкл 2% BSA с помощью пипетки при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы блокировать реактивные эпитопы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте чип парафиновой пленкой для предотвращения испарения.
   6. Через 1 ч промыть чип три раза с 1x PBS.
2. Лечение первичными антителами, вторичными антителами и DAPI и визуализация структуры с использованием конфокального микроскопа.
   1. Готовят контрольные антитела изотипа и коктейль первичных антител путем разведения антител в 1x PBS к каждой желаемой рабочей концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные детали антител перечислены в Таблице материалов. Следует использовать те же рабочие концентрации контрольных антител изотипа, что и первичных антител.
   2. Осторожно аспирировать все 1x PBS из чипа с помощью пипетки и обработать чип 200 мкл раствором первичного антитела при 4 °C в течение ночи. Накройте стружку парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение.
   3. Аспирировать раствор первичного антитела и промыть чип три раза 1x PBS.
   4. Разбавляют вторичные антитела и DAPI в 1x PBS до нужной рабочей концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае используется вторичное флуоресцентно-конъюгированное вторичное антитело Green в соотношении 1:200. DAPI использовался в соотношении 1:1000.
   5. Осторожно аспирировать все 1x PBS из чипа с помощью пипетки и обработать чип 200 мкл вторичным раствором антитела-DAPI при 4 °C в течение 3 ч. Накройте чип парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение, а затем оберните его алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
   6. Аспирировать раствор вторичного антитела-DAPI и промыть чип три раза 1x PBS.
   7. После завершения этапа окрашивания перенесите раковую конструкцию в конфокальную посуду, аккуратно захватив щипцами.
   8. Визуализируйте и захватывайте меченые клетки с помощью конфокального микроскопа(рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина волны конфокального микроскопа была скорректирована в зависимости от типа флуоресцентных маркеров. Конкретные детали антител перечислены в Таблице материалов. Чтобы эффективно определить положение клетки, было бы лучше сначала наблюдать окрашенные ЯДРА КОНСТРУКЦИИ DAPI. Длины волн обнаружения возбуждения/излучения флуоресцентных сигналов составляли 358/461 нм (DAPI, синий), 494/517 нм (зеленый) и 590/617 нм (красный). Увеличение было 4x, 10x и 20x, скорректированное от самого низкого к самому высокому.

9. Статистический анализ

1. Подсчет ячеек с помощью программы обработки изображений
   1. Запустите программу обработки изображений, чтобы подсчитать количество живых и мертвых клеток.
   2. Откройте файлы флуоресцентных изображений. Нажмите на файл | Откройте и импортируйте изображения TIFF.
   3. Преобразуйте изображения в 16-битные изображения в градациях серого. Нажмите на | изображений Тип | 16-битные оттенки серого.
   4. Отрегулируйте пороговое значение, нажав на image | Отрегулируйте | Пороговое значение, а затем выберите черный цвет ячеек.
   5. Разрежьте объединенные ячейки, нажав на | Двоичные | Водораздел для точного подсчета клеток.
   6. Подсчитайте количество ячеек, нажав на Анализ, а затем на Анализ частиц три раза; рассчитать среднее значение и представить данные как среднее ± стандартной погрешности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентные маркеры были проанализированы путем сравнения интенсивности флуоресценции.

Результаты

Гипоксический рак на чипе был разработан с использованием автоматизированной технологии 3D-печати клеток для повторения гипоксии и патологии, связанной с раком(рисунок 1). Транспортировка и потребление кислорода моделировались с использованием 3D-геом...

Обсуждение

В этом исследовании мы описываем процесс изготовления гипоксического рака на чипе на основе технологии 3D-печати клеток. Формирование гипоксического градиента в проектируемом чипе было предсказато с помощью компьютерного моделирования. Среда, которая может индуцировать гетерогенный...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
Human umbilical vein endothelial cells	Promocell	C-12200
U-87 MG cells	ATCC	ATCC HTB-14
Disposable
0.2 μm syringe filter	Sartorius	16534-K
10 mL disposable syringe	Jung Rim	10ml 21G32
10 mL glass vial	Hubena	A0039
10 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	91010
15 mL conical tube	SPL lifescience	50015
18G plastic needle	Musashi engineering	PN-18G-B
20G plastic tapered dispense tip	Musashi engineering	TPND-20G-U
22x50 glass cover	MARIENFIELD	0101142
25 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	90125
3 mL disposable syringes	HENKE-JET	4020-X00V0
40 µm cell strainer	Falcon	352360
5 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	91005
50 mL conical tube	SPL lifescience	50050
50 mL Serological pipette tip	SPL lifescience	90150
50N precision nozzle	Musashi engineering	HN-0.5ND
Aluminum foil	SINKWANG
Capillary tips	Gilson	CP1000
Cell-scrapper	SPL lifescience	90030
Confocal dish	SPL lifescience	200350
Parafilm	Bemis	PM996
Pre-coated histology slide	MATSUNAMI	MAS-11
Reservoir	SPL lifescience	23050
T-75 cell culture flask	SPL lifescience	70075
Equipment
3DX printer	T&R Biofab
Autoclave	JEIOTECH	AC-12
Centrifuger	Cyrozen	1580MGR
Confocal laser microscopy	Olympus Life Science	FV 1000
Fluorescence microscope	FISHER SCEINTIFIC	O221S366
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Hand tally counter	KTRIO
Hemocytometer	MARIENFIELD	0650030
Incubator	Panasonic	MCO-170AIC
Laminar flow cabinet	DAECHUNG SCIENCE	CB-BMMS C-001
Metal syringe	IWASHITA engineering	SUS BARREL 10CC
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Oven	JEIOTECH	OF-12, H070023
Positive displacement pipette	GILSON	NJ05652
Refrigerator	SAMSUNG	CRFD-1141
Voltex Mixer	DAIHAN scientific	VM-10
Water bath	DAIHAN SCIENTIFIC	WB-11
Water purifier	WASSER LAB	DI-GR
Materials
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072
10x PBS	Intron	IBS-BP007a
4% Paraformaldehyde	Biosesang
70% Ethanol	Daejung	4018-4410
Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
Anti-HIF-1 alpha antibody	Abcam	ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antibody	Abcam	ab88664
Anti-SOX2 antibody	Abcam	ab75485
Bovine Serum Albumin	Thermo scientific	J10857-22
Collagen from porcine skin	Dalim tissen	PC-001-1g
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher	D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2	Promocell	C22011
Fetal bovine serum	Gibco	12483-020
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Theromofisher	A-11001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Theromofisher	A-11012
High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)	Hyclone	SH30243-0
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	311413-100ML
Live/dead assay kit	Invitrogen	L3224
Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control	Abcam	ab170190
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Poly(ethylene-vinyl acetate)	Poly science	06108-500
Polydimethylsiloxane	Dowhitech	sylgard 184
Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control	Abcam	ab37415
Sodium hydroxide solution	Samchun	S0610
Triton X-100	Biosesang	TRI020-500-50
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a	COMSOL AB
IMS beamer			in-house software
SolidWorks Package	Dassault Systems SolidWorks Corporation