Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und Mesenchym/Bindegewebe von embryonalen 12,5 und 8 Wochen alten Mäusen

Zusammenfassung

Wir haben ein verallgemeinertes Protokoll entwickelt, um eine große Menge hochwertiger Einzelzellen aus dem Epithel und Mesenchym/Bindegewebe embryonaler und erwachsener Mauszungen zu dissoziieren.

Zusammenfassung

Die Zelldissoziation war ein wesentliches Verfahren für Studien auf Einzelzellebene und/oder auf Zellpopulationsebene (z. B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und primäre Zellkultur). Die Gewinnung lebensfähiger, gesunder Zellen in großen Mengen ist von entscheidender Bedeutung, und die optimalen Bedingungen dafür sind vom Gewebe abhängig. Zellpopulationen im Zungenepithel und im darunter liegenden Mesenchym/Bindegewebe sind heterogen und die Gewebestrukturen variieren in verschiedenen Regionen und in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Wir haben Protokolle zur Isolierung von Zellen aus dem Zungenepithel der Maus und Mesenchym/Bindegewebe in den frühen Entwicklungsstadien [Embryonaltag 12,5 (E12,5)] und jungen Erwachsenen (8 Wochen) getestet. Eine saubere Trennung zwischen dem Epithel und dem darunter liegenden Mesenchym/Bindegewebe war leicht zu bewerkstelligen. Um Zellen weiter zu verarbeiten und zu isolieren, sind jedoch lebensfähige gesunde Zellen in großen Mengen und die sorgfältige Auswahl des enzymatischen Verdauungspuffers, der Inkubationszeit und der Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit von entscheidender Bedeutung. Die Inkubation von getrenntem Epithel oder darunterliegendem Mesenchym/Bindegewebe in 0,25% Trypsin-EDTA für 30 min bei 37 °C, gefolgt von zentrifugation bei 200 x g für 8 min führte zu einer hohen Zellausbeute bei einer hohen Lebensfähigkeitsrate (>90%) unabhängig von den Mausstadien und Zungenregionen. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass sowohl dissoziierte epitheliale als auch mesenchymale/Bindegewebszellen aus embryonalen und adulten Zungen im zellkulturbasierten Medium mindestens 3 h überleben konnten, ohne dass die Zelllebensfähigkeit signifikant verringert wurde. Die Protokolle werden für Studien nützlich sein, die die Herstellung isolierter Zellen aus Mauszungen in frühen Entwicklungsstadien (E12.5) und jungen Erwachsenen (8 Wochen) erfordern, die eine Zelldissoziation aus verschiedenen Gewebekompartimenten erfordern.

Einleitung

Die Säugetierzunge ist ein komplexes Organ, das für Geschmack, Sprechen und Lebensmittelverarbeitung entscheidend ist. Es besteht aus mehreren Arten von hochorganisierten Geweben, die durch Mesenchym / Bindegewebe unterteilt und von einem geschichteten Epithelblatt bedeckt sind, das Geschmackspapillen und Geschmacksknospen enthält. Zellpopulationen sowohl im Zungenepithel als auch im Mesenchym/Bindegewebe sind heterogen. Um die Funktionen und die Verteilung eines bestimmten Zelltyps in der Zunge besser zu verstehen, sind Studien mit dissoziierten Zellen notwendig. Zum Beispiel ist die Einzelzell-RNA-Sequenzierung eine leistungsfähige und hochdurchsatzartige Methode zur transkriptomischen Profilierung in einzelnen Zellen, die entwickelt wurde, um das Transkriptom komplexer Gewebe mit einer Einzelzellauflösung^1,2,3,4zu verstehen. Die primäre Zellkultur hat sich als nützliches Werkzeug erwiesen, um die Funktion und Differenzierung von Stamm-/Vorläuferzellen für Geschmacksknospen zu untersuchen^5,6. Diese Studien erfordern eine große Menge an qualitativ hochwertigen isolierten Zellpopulationen (z. B. ausreichende Gesamtzellzahl bei richtiger Konzentration und hoher Lebensfähigkeit).

Daher besteht die Notwendigkeit, Zellen aus verschiedenen Regionen des Lingualgewebes und in verschiedenen Entwicklungsstadien zu isolieren. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Zelldissoziation vom Zungenepithel und dem darunter liegenden Mesenchym / Bindegewebe. Hier berichten wir über eine optimierte Zelldissoziationsmethode, um Zellen für Experimente vorzubereiten, die eine hohe Qualität lebender Zellen erfordern, z. B. für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung und primäre Stammzellkulturen. Wir fanden heraus, dass die Auswahl des enzymatischen Aufschlusspuffers, das sanfte Pipettieren, die Auswahl des Resuspensionsmediums und die optimale Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit entscheidend sind, um diese großen Mengen hochwertiger Zellen zu erzeugen.

Protokoll

Die Verwendung von Tieren (C57BL / 6-Mäuse während der gesamten Studie) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Georgia genehmigt und entsprach den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Tieren für die Forschung.

1. Verwendung durch Tiere

HINWEIS: Mäuse wurden in der Tiereinrichtung der Abteilung für Tier- und Milchwissenschaften an der University of Georgia bei 22 ° C unter 12-Stunden-Tag/Nacht-Zyklen gezüchtet und gepflegt.

1. Bezeichnen Sie den Mittag des Tages des Vaginalpfropfens bei Mäusen als embryonalen (E) Tag 0,5. Verwenden Sie Embryonen bei E12.5 und postnatale Mäuse im Alter von 8 Wochen für die folgenden Experimente.

2. Vorbereitung vor dem Experiment

HINWEIS: Die für dieses Protokoll erforderlichen Instrumente sind in der Materialtabelleaufgeführt.

1. Autoklavinstrumente vor dem Experiment. Sterilisieren Sie Instrumente während des Experiments mit einem Perlensterilisator.
2. Reinigen Sie den Operationsbereich, das Seziermikroskop und die Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanoltüchern. Schalten Sie das UV-Licht der Biosicherheitswerkbank ein und lassen Sie es vor dem Versuchsvorgang 20 Minuten lang eingeschaltet.
3. Eine Enzymmischung aus 1:1-Dispase (5,0 mg/ml) und Kollagenase (2,0 mg/ml) wird auf eine Endkonzentration von 2,5 bzw. 1,0 mg/ml vorbereitet und die Lösung mit 0,22 μm Spritzenfilter⁷filtriert.
   1. Bereiten Sie 1 ml Enzymmischung für eine erwachsene Zunge oder 0,5 ml für eine bestimmte Zungenregion (z. B. hintere oder vordere Zunge) vor.
   2. Bereiten Sie 2 ml Enzymmischung für embryonale Zungen vor.
4. Machen Sie 10 ml 2,5% BSA in 0,1 M PBS und filtern Sie die Lösung mit einer 1 ml Spritze und einem 0,22 μm Spritzenfilter.
5. Machen Sie 500 μL von 5% FBS in DMEM/F12.
6. Machen Sie 3 ml DMEM/F12 mit 10% FBS und 1% BSA und filtern Sie die Lösung mit 1 ml Spritze und 0,22 μm Spritzenfilter.

3. Trennung des Zungenepithels vom Mesenchym/darunterliegenden Bindegewebe

1. Trennung des Epithels vom Mesenchym einer E12.5-Mauszunge
   1. Euthanasieren Sie trächtige weibliche Mäuse, die E12,5-Embryonen tragen, indem Sie sie in eine CO_2-Kammer legen, gefolgt von zervikaler Dislokation.
      HINWEIS: Mausembryonen bei E12.5 werden nach 12:00 Uhr (nachmittags) am 12. Tag nach dem Nachweis des Vaginalpfropfens bei den trächtigen weiblichen Mäusen entnommen.
   2. Übertragen Sie Mäuse in den Operationsbereich. Befeuchten Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell in die Operationsstelle gelangt.
   3. Öffnen Sie den Bauch mit einer Schere, um die Uterushörner freizulegen, die Embryonen tragen. Sezieren Sie die Uterushörner mit einer Schere und übertragen Sie sie in 15 ml frische Tyrode-Lösung in einer 100-mm-Kulturschale.
   4. Sezieren Sie die Embryonen (Abbildung 1A₁) unter einem Seziermikroskop mit einer Minischere und einer feinen Zette aus den Uterushörnern heraus.
   5. Öffnen Sie die Mundhöhle vorsichtig mit einer feinen Zette weit und sezieren Sie die Zunge mit einer Minischere vom Unterkiefer ab (Abbildung 1A₂).
   6. Waschen Sie die Zungen mit 15 ml frischer steriler Tyrode-Lösung in einer 100-mm-Kulturschale.
   7. Übertragen Sie das Gewebe auf 2 ml Enzymmischung aus Dispase (2,5 mg / ml) und Kollagenase (1,0 mg / ml) in einer 35 mm Kulturschale mit Spatel und feiner Zette in einer Biosicherheitswerkbank. 20 min bei 37 °C inkubieren.
   8. Die Zungen in eine 100-mm-Kulturschale auf 15 ml frische sterile Tyrode-Lösung geben und das Mesenchym vorsichtig mit einer feinen Handzette vom Epithel von der ventralen Seite entfernen.
      HINWEIS: Epithelblätter können während der Inkubation ohne mechanische Kraft getrennt werden.
   9. Waschen Sie das getrennte Epithel und Mesenchym zweimal in 15 ml frischer steriler Tyrode-Lösung in einer 100-mm-Kulturschale.
      HINWEIS: Die Aktivitäten von Dispase und Kollagenase werden durch EDTA im Zelldissoziationsverfahren gehemmt (Schritt 4.1).
2. Trennung des Zungenepithels vom darunter liegenden Bindegewebe erwachsener Mäuse
   1. Euthanasieren Sie die Maus im Alter von 8 Wochen, indem Sie sie in eine CO_2-Kammer legen. Bestätigen Sie, dass die Maus ohne Atemzüge und Vorpfoten-Pinch-Reaktion eingeschläfert wurde.
   2. Übertragen Sie die Mäuse in den Operationsbereich. Befeuchten Sie den Mauskopf mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell in die Mundhöhle gelangt.
   3. Schneiden Sie die Mundwinkel entlang der Wange mit einer Schere, um die Mundhöhle zu öffnen. Sezieren Sie die Zunge mit dem Unterkiefer (Abbildung 1B₁) und legen Sie sie in eine Plastikschale mit einer Schicht Plastikfolie.
   4. Mit einer chirurgischen Handzette, um die Zunge unter einem Seziermikroskop zu halten, injizieren Sie die Enzymmischung aus Dispase (2,5 mg / ml) und Kollagenase (1,0 mg / ml) in den subepithelialen Raum der Zunge durch dieSchneide (Abbildung 1B₁, Pfeile) der hinteren Zunge.
      1. Injizieren Sie 1 ml Enzymmischung gleichmäßig auf die gesamte Zunge zur Gewebeentnahme von der vorderen und hinteren Zunge.
      2. Injizieren Sie 0,5 ml Enzymmischung lokal auf die Vorderzunge zur Gewebeentnahme von der Zungenspitze oder in die hintere Zunge zur Entnahme von Zirkumvallat-Papillengewebe.
         HINWEIS: Die Zunge schwillt an, wenn sich das Enzym ansammelt (Abbildung 1B₂). Eine sanfte Injektion des Enzyms kann verhindern, dass druckbelastend das Epithel schädigt und so viel Enzym wie möglich in der Zunge hält.
   5. Die Zunge mit Plastikfolie umwickeln und die Zunge 30 min bei 37 °C inkubieren.
   6. Verwenden Sie eine Mini-Schere, um die Zungenspitze und / oder die zirkumvallate Papille zu sezieren, und verwenden Sie Spatel und feine Zette, um Gewebe in 15 ml frische sterile Tyrode-Lösung in einer 100-mm-Kulturschale zu übertragen.
   7. Trennen Sie das Epithel vom darunter liegenden Bindegewebe im enzymverdauten Subepithelraum mit einer Minischere. Schneiden Sie das Gewebe entsprechend den Anforderungen nachgeschalteter Experimente auf eine geeignete Größe.
   8. Waschen Sie das abgetrennte Epithel und das darunter liegende Bindegewebe zweimal in 15 ml frischer steriler Tyrode-Lösung in einer 100-mm-Kulturschale.
      HINWEIS: Die Aktivitäten von Dispase und Kollagenase werden durch EDTA im Zelldissoziationsverfahren gehemmt (Schritt 4.1).

4. Zelldissoziation

HINWEIS: Das hier beschriebene Zelldissoziationsprotokoll kann sowohl bei embryonalen als auch bei 8 Wochen alten E12.5-Mäusen auf das Zungenepithel und das Mesenchym-/Bindegewebe angewendet werden. Um den Zellverlust während des Rührens und übertragen der Zellsuspension zu reduzieren, verwenden Sie handelsübliche Pipettenspitzen mit geringer Retention oder vorbeschichtete Pipettenspitzen mit 2,5% BSA in 0,1 M PBS bei pH 7,4⁸.

1. Das Gewebe mit Spatel und feiner Zette auf 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA in einer neuen 35 mm Kulturschale für 30 min bei 37 °C übertragen. Rühren Sie das Gewebe alle 5 Minuten vorsichtig mit 1 ml Pipettenspitzen.
   HINWEIS: Schneiden Sie die Pipettenspitze nicht ab, da die Schneide die dissoziierten Zellen physisch beschädigen kann.
2. Fügen Sie 500 μL von 5% FBS in DMEM/F12 hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und übertragen Sie das Medium in ein 5 mL niedrig bindendes Zentrifugenröhrchen.
3. Zentrifugenzellensuspension bei 200 x g für 8 min bei Raumtemperatur und Entfernen des Überstands.
4. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 3 ml DMEM/F12 mit 10% FBS und 1% BSA mit 1 mL Pipettenspitzen und filtern Sie die Zellen mit einem 70 μm Zellsieb, gefolgt von einem 35 μm Zellsieb.
5. Zentrifugenzellsuspension bei 200 x g für 8 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums und lassen Sie 50-300 μL als letztes Volumen, um die Zellen wieder aufzuhängen.
   HINWEIS: Passen Sie die Konzentration der Zellen entsprechend den Anforderungen nachgeschalteter Experimente an, indem Sie das Endvolumen der Einzelzellsuspension ändern.

5. Zellzählung und Lebensfähigkeitstest mit Hämozytometer

HINWEIS: Um die Messgenauigkeit zu verbessern, werden 3 technische Replikate für jede Probe empfohlen.

1. Mischen Sie vorsichtig 5-10 μL der Einzelzellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypanblau und fügen Sie es auf das Hämozytometer hinzu.
   HINWEIS: Reinigen Sie das Hämozytometer vor Gebrauch gründlich mit 70% Ethanol. Staubpartikel auf dem Hämozytometer werden dunkelblau gefärbt und beeinträchtigen die Genauigkeit der Lebensfähigkeitsprüfung. Überprüfen Sie das Hämozytometer unter einem Mikroskop.
2. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die Anzahl der lebenden Zellen (weiß) und die Anzahl der toten Zellen (dunkelblau), die von Trypanblau gefärbt sind(Abbildung 2,Pfeile) bzw. in 4 Quadraten mit 16 Gittern(Abbildung 2)mit invertiertem Mikroskop mit Bildgebungssystem.
3. Berechnen Sie die Zellkonzentration:
   Zellkonzentration =
   1. Berechnen Sie die Lebensfähigkeit:
      Lebensfähigkeit =

Ergebnisse

Trennung des Zungenepithels vom darunter liegenden Mesenchym/Bindegewebe
In der embryonalen Mauszunge ist nach der richtigen Enzymverdauung eine Lücke im subepithelialen Raum sichtbar. Epithelblätter einiger Zungen werden während der Inkubation ohne mechanische Kraft getrennt.

Bei der erwachsenen Mauszunge wird eine erfolgreiche Enzyminjektion durch die Schwellung in den injizierten Bereichen angezeigt (Abbildung 1B₂

Diskussion

Bisher gibt es kein detailliertes Protokoll für die Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und dem darunter liegenden Mesenchym/ Bindegewebe. Dieses aktuelle Zelldissoziationsprotokoll bietet ein reproduzierbares Verfahren, um eine Einzelzellsuspension mit einer hohen Zelllebensfähigkeit (>90%) aus Mauszungengewebe, einschließlich Epithelblättern und Mesenchym-/Bindegewebe sowohl im embryonalen als auch im postnatalen Stadium, obwohl isolierte Zellen von E12.5 und erwachsenen Mäusen unterschiedlich groß sind. Zum B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
bovine serum albumin (BSA)	Gold Biotechnology	A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J)	The Jackson Laboratory	000664
collagenase (Collagenase A)	Sigma-Aldrich	10103586001
culture dish (35 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-103G
culture dish (100 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-107G
dispase (Dispase II)	Sigma-Aldrich	04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors)	Find Science Tool	91460-11
DMEM/F12	Gibco	11320033
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps)	Find Science Tool	11293-00
hemocytometer	Hausser Scientific	3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System)	Life Technologies	AMEX1000
low retention pipette tips	METTLER TOLEDO	17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors)	Fine Science Tool	15800-01
plastic warp	VWR	46610-056
spatula (Moria Spoon)	Fine Science Tool	10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps)	Fine Science Tool	11223-20
Trypan blue	Gibco	15250061
Tyrode’s solution	Sigma-Aldrich	T2145-10L	made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA	Gibco	25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Hoefer	33946	made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter	Genesee Scientific	25-243
70% ethanol	Koptec	233919	made from 100% ethanol
1-mL syringe	BD	8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube	Eppendorf	30122348
30-G needle	BD	9193532
35-μm cell strainer	Falcon	64750
70-μm cell strainer	Falcon	64752