Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas

Resumo

Desenvolvemos um protocolo generalizado para dissociar uma grande quantidade de células únicas de alta qualidade a partir do epitélio e mesenquime/tecido conjuntivo de línguas de camundongos embrionários e adultos.

Resumo

A dissociação celular tem sido um procedimento essencial para estudos no nível de células individuais e/ou a nível de população celular (por exemplo, sequenciamento de RNA de células únicas e cultura celular primária). Produzir células viáveis e saudáveis em grandes quantidades é crítico, e as condições ideais para fazê-lo são dependentes de tecidos. As populações celulares no epitélio da língua e no tecido mesenquime/conjuntivo subjacente são heterogêneas e as estruturas teciduais variam em diferentes regiões e em diferentes estágios de desenvolvimento. Testamos protocolos para isolar células do epitélio da língua do rato e do tecido mesenquime/conjuntivo nas fases de desenvolvimento inicial [dia embrionário 12.5 (E12.5)] e jovens adultos (8 semanas). Uma separação limpa entre o epitélio e o tecido mesenquime/conjuntivo subjacente foi fácil de realizar. No entanto, para processar e isolar ainda mais as células, produzir células saudáveis viáveis em grandes quantidades, e seleção cuidadosa de tampão de digestão enzimática, tempo de incubação e velocidade e tempo de centrifugação são críticos. Incubação de epitélio separado ou tecido conjuntivo/mesenquime subjacente em 0,25% Trippsin-EDTA por 30 min a 37 °C, seguido por centrifugação a 200 x g por 8 min resultou em um alto rendimento de células a uma alta taxa de viabilidade (>90%) independentemente dos estágios do rato e regiões da língua. Além disso, descobrimos que tanto células epiteliais dissociadas quanto mesenquimais/conjuntivas de línguas embrionárias e adultas poderiam sobreviver no meio baseado na cultura celular por pelo menos 3 h sem uma diminuição significativa da viabilidade celular. Os protocolos serão úteis para estudos que requerem a preparação de células isoladas de línguas de camundongos em estágios de desenvolvimento precoce (E12,5) e jovens adultos (8 semanas) que requerem dissociação celular de diferentes compartimentos teciduais.

Introdução

A língua dos mamíferos é um órgão complexo crítico para o sabor, fala e processamento de alimentos. É composta por vários tipos de tecidos altamente organizados compartimentados por mesenchyme/tecido conjuntivo e cobertos por uma folha epitelial estratificada contendo papilas gustativas e papilas gustativas. Populações celulares em epitélio de língua e tecido mesenquime/conjuntivo são heterogêneas. Para entender melhor as funções e distribuição de um determinado tipo de células na língua, são necessários estudos com células dissociadas. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de célula única é um método poderoso e de alto rendimento para o perfil transcriômico em células individuais, que é projetado para entender o transcriptome de tecido complexo em uma resolução unicelular^1,2,3,4. A cultura celular primária tem sido comprovadamente uma ferramenta útil para estudar a função e diferenciação de células-tronco/progenitoras para as papilas gustativas^5,6. Esses estudos requerem uma grande quantidade de populações de células isoladas de alta qualidade (por exemplo, número celular total suficiente com concentração adequada e alta viabilidade).

Assim, é necessário isolar células de diferentes regiões dos tecidos linguais e em diferentes estágios de desenvolvimento. Atualmente, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e tecido mesenquime/conjuntivo subjacente. Aqui, relatamos um método otimizado de dissociação celular para preparar células para experimentos que requerem uma alta qualidade de células vivas, como para sequenciamento de RNA de células únicas e culturas primárias de células-tronco. Descobrimos que a seleção de tampão de digestão enzimática, pipetação suave, seleção de meio de resuspensão e tempo e velocidade de centrifugação ideais são cruciais para gerar essas grandes quantidades de células de alta qualidade.

Protocolo

O uso de animais (C57BL/6 camundongos ao longo do estudo) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia e esteve de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para cuidados e uso de animais para pesquisa.

1. Uso de animais

NOTA: Os camundongos foram criados e mantidos na instalação animal do departamento de Ciência Animal e Leite na Universidade da Geórgia a 22 °C sob ciclos de dia/noite de 12h.

1. Designe meio-dia do dia da detecção de plugue vaginal em camundongos como embrionário (E) dia 0,5. Use embriões em E12,5 e camundongos pós-natais com 8 semanas de idade para os seguintes experimentos.

2. Preparação antes do experimento

NOTA: Os instrumentos necessários para este protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Instrumentos autoclave antes do experimento. Esterilizar instrumentos usando um esterilizador de contas durante o experimento.
2. Limpe a área cirúrgica, o microscópio de dissecação e o armário de biossegurança usando 70% de lenços de etanol. Ligue a luz UV do armário de biossegurança e mantenha-a acesa por 20 minutos antes do procedimento experimental.
3. Prepare uma mistura enzimática de 1:1 dispase (5.0 mg/mL) e colagenase (2,0 mg/mL) para uma concentração final de 2,5 e 1,0 mg/mL, respectivamente, e filtre a solução usando filtro de seringa 0,22 μm⁷.
   1. Prepare 1 mL de mistura enzimápica para uma língua adulta ou 0,5 mL para uma região específica da língua (por exemplo, posterior ou língua anterior).
   2. Prepare 2 mL de mistura enzimápica para línguas embrionárias.
4. Faça 10 mL de 2,5% BSA em 0,1 M PBS e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.
5. Faça 500 μL de 5% de FBS em DMEM/F12.
6. Faça 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.

3. Separação do epitélio da língua do mesenquime/tecido conjuntivo subjacente

1. Separação do epitélio do mesenquime de uma língua de rato E12.5
   1. Eutanize camundongos gestantes cronometrado carregando embriões E12,5 colocando-o em uma câmara de CO₂ seguido de luxação cervical.
      NOTA: Os embriões de camundongos no E12.5 são coletados após as 12:00 (tarde) no 12º dia após a detecção do plugue vaginal nos camundongos gestantes.
   2. Transfira ratos para a área cirúrgica. Molhe o abdômen do rato usando 70% de etanol para evitar que a pele entre no local de operação.
   3. Abra o abdômen usando uma tesoura dissecando para expor os chifres uterinos que carregam embriões. Disseque os chifres uterinos usando tesouras dissecando e transfira para 15 mL de solução fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
   4. Dissecar os embriões (Figura 1A₁) a partir de chifres uterinos sob um microscópio dissecando usando mini-tesouras e fórceps finos.
   5. Abra cuidadosamente a cavidade da boca, usando fórceps finos e dissecando a língua fora da mandíbula usando mini-tesoura(Figura 1A₂).
   6. Lave as línguas usando 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
   7. Transfira os tecidos para 2 mL de mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) em um prato de cultura de 35 mm com espátula e fórceps finos em um armário de biossegurança. Incubar por 20 min a 37 °C.
   8. Transfira as línguas para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm e remova suavemente o mesenquime do epitélio do lado ventral usando fórceps finos.
      NOTA: As folhas epiteliais podem ser separadas sem força mecânica durante a incubação.
   9. Lave a epitélio separada e mesenquime duas vezes em 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
      NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).
2. Separação do epitélio da língua do tecido conjuntivo subjacente de camundongos adultos
   1. Eutanize o rato com 8 semanas de idade colocando-o em uma câmara de CO_2. Confirme se o mouse é eutanizado sem respiração e resposta de pressão dianteira.
   2. Transfira os ratos para a área cirúrgica. Molhe a cabeça do rato usando 70% de etanol para evitar que os peles entrem na cavidade oral.
   3. Corte os cantos da boca ao longo da bochecha usando uma tesoura dissecando para abrir a cavidade oral. Dissecar a língua com mandíbula(Figura 1B₁) e coloque-a em um prato plástico com uma camada de plástico.
   4. Utilizando fórceps cirúrgicos para segurar a língua sob um microscópio dissecando, injete a mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) no espaço sub-epitelial da língua através da borda de corte(Figura 1B₁, setas) da língua posterior.
      1. Injete 1 mL de mistura enzimada uniformemente na língua inteira para coleta de tecido tanto da língua anterior quanto posterior.
      2. Injete 0,5 mL de mistura de enzima localmente à língua anterior para coleta de tecido da ponta da língua ou para a língua posterior para a coleta de tecido de papila circunvaltada.
         NOTA: A língua vai inchar à medida que a enzima se acumula(Figura 1B₂). A injeção suave da enzima pode evitar que a pressão danifique o epitélio e mantenha o máximo de enzimas possível na língua.
   5. Enrole a língua com plástico e incubar a língua por 30 min a 37 °C.
   6. Use mini-tesoura para dissecar a ponta da língua e/ou papila circunvaltada, e use espátula e fórceps finos para transferir tecido para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm.
   7. Separe o epitélio do tecido conjuntivo subjacente no espaço sub-epitelial digerido pela enzima usando mini-tesouras. Corte os tecidos em um tamanho adequado de acordo com a exigência de experimentos a jusante.
   8. Lave o epitélio separado e o tecido conjuntivo subjacente duas vezes em 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm.
      NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).

4. Dissociação celular

NOTA: O protocolo de dissociação celular descrito aqui pode ser aplicado ao epitélio da língua e ao tecido mesenquime/conjuntivo em camundongos embrionários E12,5 e 8 semanas de idade. Para reduzir a perda de celular durante a agitação e transferência de suspensão celular, use dicas comerciais de pipeta de baixa retenção ou pontas de pipeta pré-revestidas com 2,5% de BSA em 0,1 M PBS no pH 7.4⁸.

1. Transfira os tecidos usando espátula e fórceps finos para 3 mL de 0,25% trypsin-EDTA em um novo prato de cultura de 35 mm por 30 min a 37 °C. Agitar suavemente tecidos a cada 5 minutos com pontas de pipeta de 1 mL.
   NOTA: Não corte a ponta da pipeta, pois a borda de corte pode danificar fisicamente as células dissociadas.
2. Adicione 500 μL de 5% de FBS no DMEM/F12 para parar a reação e transfira o meio para um tubo de centrífuga de baixa ligação de 5 mL.
3. Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente e remova o supernasce.
4. Suspenda suavemente as células em 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA usando pontas de pipeta de 1 mL e filtre as células usando um coador de células de 70 μm, seguido por um coador de células de 35 μm.
5. Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente. Remova a maior parte do meio e deixe 50-300 μL como o volume final para re-suspender as células.
   NOTA: Ajuste a concentração das células de acordo com os requisitos dos experimentos a jusante alterando o volume final de suspensão de célula única.

5. Teste de contagem de células e viabilidade usando hemótmetro

NOTA: Para melhorar a precisão da medição, são recomendadas 3 réplicas técnicas para cada amostra.

1. Misture suavemente 5-10 μL da suspensão de célula única com um volume igual de azul Trypan e adicione ao hemócito.
   NOTA: Limpe bem o hemótmetro usando 70% de etanol antes de usar. As partículas de poeira no hemócito ficarão manchadas em azul escuro e afetarão a precisão do teste de viabilidade. Verifique o hemótmetro sob um microscópio.
2. Conte o número total de células, o número de células vivas (brancas) e o número de células mortas (azul escuro) manchadas pelo azul Trypan(Figura 2, setas) respectivamente em 4 quadrados com 16 grades(Figura 2) usando microscópio invertido com sistema de imagem.
3. Calcule a concentração celular:
   Concentração celular =
   1. Calcule a viabilidade:
      Viabilidade =

Resultados

Separação do epitélio da língua do tecido mesenquime/conjuntivo subjacente
Na língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível após a digestão adequada da enzima. Folhas epiteliais de algumas línguas são separadas sem força mecânica durante a incubação.

Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas (Figura 1B₂), ...

Discussão

Até o momento, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e do tecido conjuntivo/mesenquime subjacente. Este protocolo de dissociação celular atual fornece um procedimento reprodutível para gerar uma única suspensão celular com uma alta viabilidade celular (>90%) de tecidos de língua de camundongos, incluindo folhas epiteliais e tecidos mesenquime/conjuntivos em estágios embrionários e pós-natais, embora células isoladas de E12,5 e camundongos adulto...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
bovine serum albumin (BSA)	Gold Biotechnology	A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J)	The Jackson Laboratory	000664
collagenase (Collagenase A)	Sigma-Aldrich	10103586001
culture dish (35 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-103G
culture dish (100 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-107G
dispase (Dispase II)	Sigma-Aldrich	04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors)	Find Science Tool	91460-11
DMEM/F12	Gibco	11320033
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps)	Find Science Tool	11293-00
hemocytometer	Hausser Scientific	3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System)	Life Technologies	AMEX1000
low retention pipette tips	METTLER TOLEDO	17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors)	Fine Science Tool	15800-01
plastic warp	VWR	46610-056
spatula (Moria Spoon)	Fine Science Tool	10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps)	Fine Science Tool	11223-20
Trypan blue	Gibco	15250061
Tyrode’s solution	Sigma-Aldrich	T2145-10L	made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA	Gibco	25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Hoefer	33946	made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter	Genesee Scientific	25-243
70% ethanol	Koptec	233919	made from 100% ethanol
1-mL syringe	BD	8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube	Eppendorf	30122348
30-G needle	BD	9193532
35-μm cell strainer	Falcon	64750
70-μm cell strainer	Falcon	64752