Диссоциация клеток из эпителия языка и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных мышей 12,5 и 8 недель

Резюме

Мы разработали обобщенный протокол для диссоциативного большого количества высококачественных одиночных клеток из эпителия и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных и взрослых мышей.

Аннотация

Диссоциация клеток была важной процедурой для исследований на уровне отдельных клеток и/или на уровне клеточной популяции (например, секвенирование одноклеточной РНК и первичная клеточная культура). Получение жизнеспособных, здоровых клеток в больших количествах имеет решающее значение, и оптимальные условия для этого зависят от тканей. Клеточные популяции в эпителии языка и лежащей в его основе мезенхиме/ соединительной ткани являются гетерогенными, и тканевые структуры различаются в разных областях и на разных стадиях развития. Мы протестировали протоколы выделения клеток из эпителия языка мыши и мезенхимы/соединительной ткани на ранних стадиях развития [эмбриональный день 12,5 (E12,5)] и молодых взрослых (8 недель). Чистое разделение между эпителием и подлежащей мезенхимой/соединительной тканью было легко осуществить. Однако для дальнейшей обработки и изоляции клеток, дающих жизнеспособные здоровые клетки в больших количествах, и тщательный выбор ферментативного буфера пищеварения, времени инкубации и скорости и времени центрифугирования имеют решающее значение. Инкубация отделенного эпителия или подлежащей мезенхимы/соединительной ткани в 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 30 мин при 37 °C с последующим центрифугированием при 200 х г в течение 8 мин приводила к высокому выходу клеток при высокой скорости жизнеспособности (>90%) независимо от стадий мыши и областей языка. Более того, мы обнаружили, что как диссоциированные эпителиальные, так и мезенхимальные /соединительные клетки из эмбрионального и взрослого языков могут выживать в среде на основе клеточной культуры в течение не менее 3 ч без значительного снижения жизнеспособности клеток. Протоколы будут полезны для исследований, требующих подготовки изолированных клеток из языков мыши на ранних стадиях развития (E12.5) и молодых взрослых (8-недельных) стадиях, требующих диссоциации клеток из разных тканевых компартментов.

Введение

Язык млекопитающих является сложным органом, критически важным для вкуса, речи и обработки пищи. Он состоит из нескольких типов высокоорганизованных тканей, разделенных мезенхимой / соединительной тканью и покрытых стратифицированным эпителиальным листом, содержащим вкусовые сосочки и вкусовые рецепторы. Клеточные популяции как в эпителии языка, так и в мезенхиме/соединительной ткани неоднородны. Чтобы лучше понять функции и распределение определенного типа клеток на языке, необходимы исследования с использованием диссоциированных клеток. Например, секвенирование одноклеточной РНК является мощным и высокопроизводительный методом транскриптомного профилирования в отдельных клетках, который предназначен для понимания транскриптома сложной ткани при одноклеточном разрешении^1,2,3,4. Было доказано, что первичная клеточная культура является полезным инструментом для изучения функции и дифференцировки стволовых/прогениторных клеток для вкусовых рецепторов^5,6. Эти исследования требуют большого количества высококачественных изолированных клеточных популяций (например, достаточное общее количество клеток при правильной концентрации и высокой жизнеспособности).

Таким образом, возникает необходимость выделения клеток из разных областей лингвальных тканей и на разных стадиях развития. В настоящее время не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Здесь мы сообщаем об оптимизированном методе диссоциации клеток для подготовки клеток к экспериментам, требующим высокого качества живых клеток, таких как секвенирование одноклеточной РНК и первичные культуры стволовых клеток. Мы обнаружили, что выбор ферментативного буфера пищеварения, щадящее пипетирование, выбор среды ресуспензии, а также оптимальное время и скорость центрифугирования имеют решающее значение для создания этих больших количеств высококачественных клеток.

протокол

Использование животных (мыши C57BL/6 на протяжении всего исследования) было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Джорджии и соответствовало Руководящим принципам Национального института здравоохранения по уходу и использованию животных для исследований.

1. Использование животными

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были выведены и содержались в животноводческом учреждении факультета животноводства и молочных наук в Университете Джорджии при 22 ° C при 12-часовых циклах дня и ночи.

1. Назначают полудень дня обнаружения влагалищной пробки у мышей как эмбриональный (Е) день 0,5. Используйте эмбрионы в E12.5 и постнатальных мышей в возрасте 8 недель для следующих экспериментов.

2. Подготовка перед экспериментом

ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты, необходимые для этого протокола, перечислены в Таблице материалов.

1. Автоклавные приборы перед экспериментом. Стерилизуйте инструменты с помощью стерилизатора бисера во время эксперимента.
2. Очистите хирургическую область, рассекающий микроскоп и шкаф биобезопасности, используя 70% этаноловые салфетки. Включите ультрафиолетовый свет шкафа биобезопасности и держите его в течение 20 минут до начала экспериментальной процедуры.
3. Готовят ферментную смесь 1:1 диспазы (5,0 мг/мл) и коллагеназы (2,0 мг/мл) до конечной концентрации 2,5 и 1,0 мг/мл соответственно и фильтруют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм^7.
   1. Приготовьте 1 мл ферментной смеси для взрослого языка или 0,5 мл для определенной области языка (например, заднего или переднего языка).
   2. Приготовить 2 мл ферментной смеси для эмбриональных языков.
4. Сделайте 10 мл 2,5% BSA в 0,1 М PBS и отфильтруйте раствор с помощью шприца 1 мл и шприцевого фильтра 0,22 мкм.
5. Сделайте 500 мкл 5% FBS в DMEM/F12.
6. Сделайте 3 мл DMEM/F12, содержащих 10% FBS и 1% BSA, и процедить раствор с помощью шприца 1 мл и шприцевого фильтра 0,22 мкм.

3. Отделение эпителия языка от мезенхимы/подлежащей соединительной ткани

1. Отделение эпителия от мезенхимы мышиного языка E12.5
   1. Усыпить беременных самок мышей, несущих эмбрионы E12.5, поместив их в камеру CO₂ с последующим вывихом шейки матки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы мышей при E12.5 собирают после 12 часов дня (днем) на 12-й день после обнаружения влагалищной пробки у беременных самок мышей.
   2. Перенесите мышей в хирургическую зону. Смочите брюшко мыши, используя 70% этанола, чтобы предотвратить попадание шерсти в место работы.
   3. Откройте живот с помощью рассекающих ножниц, чтобы обнажить рога матки, несущие эмбрионы. Рассеките рога матки с помощью рассекающих ножниц и переложите его на 15 мл свежего раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
   4. Рассекать эмбрионы(рисунок 1А₁₎из рогов матки под рассекающим микроскопом с помощью мини-ножниц и тонких щипцов.
   5. Осторожно широко откройте полость рта с помощью тонких щипцов и рассекайте язык от мандиблы с помощью мини-ножниц(рисунок 1А_2).
   6. Вымойте языки, используя 15 мл свежего стерильного раствора Tyrode в 100 мм чашке для культуры.
   7. Переложить ткани на 2 мл ферментной смеси диспазы (2,5 мг/мл) и коллагеназы (1,0 мг/мл) в культурную посуду 35 мм с лопаткой и тонкими щипцами в шкафу биобезопасности. Инкубировать в течение 20 мин при 37 °C.
   8. Перенесите языки на 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде и аккуратно удалите мезенхиму из эпителия с вентральной стороны с помощью тонких щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальные листы могут быть отделены без механической силы во время инкубации.
   9. Отделенная эпителия и мезенхима вымыть дважды в 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность диспазы и коллагеназы будет ингибироваться ЭДТА в процедуре диссоциации клеток (этап 4.1).
2. Отделение эпителия языка от подлежащей соединительной ткани взрослых мышей
   1. Усыпить мышь в возрасте 8 недель, поместив ее в камеру CO_2. Убедитесь, что мышь усыплена без дыхания и реакции защемления.
   2. Перенесите мышей в хирургическую область. Смочите голову мыши, используя 70% этанола, чтобы предотвратить попадание шерсти в ротовую полость.
   3. Срежьте уголки рта вдоль щеки с помощью рассекающих ножниц, чтобы открыть ротовую полость. Рассекните язык с помощью мандиблы(рисунок 1В₁₎и поместите его в пластиковую посуду со слоем полиэтиленовой пленки.
   4. Используя хирургические щипцы для удержания языка под рассекающим микроскопом, вводят ферментную смесь диспазы (2,5 мг/мл) и коллагеназы (1,0 мг/мл) в субэпителиальное пространство языка через режущую кромку(рисунок 1B_1,стрелки) заднего языка.
      1. Равномерно ввести 1 мл ферментной смеси во весь язык для сбора тканей как с переднего, так и с заднего языка.
      2. Вводят 0,5 мл ферментной смеси локально в передний язык для сбора тканей с кончика языка или на задний язык для циркумвалляционного сбора ткани сосочков.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Язык будет набухать по мере накопления фермента(рисунок 1B_2). Мягкая инъекция фермента может предотвратить давление от повреждения эпителия и сохранить как можно больше фермента в языке.
   5. Оберните язык полиэтиленовой пленкой и высиживание языка в течение 30 мин при 37 °C.
   6. Используйте мини-ножницы для рассечения кончика языка и/ или околоколлеобразного сосочка, а также используйте шпатель и тонкие щипцы для переноса ткани в 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
   7. Отделите эпителий от подлежащей соединительной ткани в переваренный ферментами субэпителиальном пространстве с помощью мини-ножниц. Обрежьте ткани до надлежащего размера в соответствии с требованиями последующих экспериментов.
   8. Вымойте отделенный эпителий и подлежащую соединительную ткань дважды в 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность диспазы и коллагеназы будет ингибироваться ЭДТА в процедуре диссоциации клеток (этап 4.1).

4. Диссоциация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол диссоциации клеток, описанный здесь, может быть применен к эпителию языка и мезенхиме/соединительной ткани как у эмбриональных, так и у 8-недельных мышей E12.5. Чтобы уменьшить потерю клеток при перемешивании и переносе клеточной суспензии, используйте коммерческие наконечники пипеток с низким удержанием или предварительно покрытые наконечники пипеток с 2,5% BSA в 0,1 М PBS при рН^{7,4 8.}

1. Переложить ткани с помощью шпателя и мелкодисперсных щипцов до 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в новой 35-мм культурной посуде в течение 30 мин при 37 °C. Осторожно перемешивать ткани каждые 5 минут кончиками пипеток 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не режут наконечник пипетки, так как режущая кромка может физически повредить диссоциированные клетки.
2. Добавьте 500 мкл 5% FBS в DMEM/F12, чтобы остановить реакцию и перенести среду в 5 мл низкосвязывающей центрифужной трубки.
3. Центрифужная клеточная суспензия по 200 х г в течение 8 мин при комнатной температуре и удаление супернатанта.
4. Осторожно повторно суспендируйте клетки в 3 мл DMEM/F12, содержащих 10% FBS и 1% BSA, используя наконечники пипетки 1 мл, и фильтруйте клетки с помощью клеточного ситечкового фильтра 70 мкм, а затем 35-мкм клеточного ситечко.
5. Суспензия центрифужных ячеек по 200 х г в течение 8 мин при комнатной температуре. Удалите большую часть среды и оставьте 50-300 мкл в качестве конечного объема для повторной приостановки клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию клеток в соответствии с требованиями последующих экспериментов путем изменения конечного объема одноклеточной суспензии.

5. Подсчет клеток и тест жизнеспособности с помощью гемоцитометра

ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения точности измерений для каждого образца рекомендуется использовать 3 технические реплики.

1. Аккуратно смешать 5-10 мкл одноклеточной суспензии с равным объемом трипана синего и добавить на гемоцитометр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите гемоцитометр, используя 70% этанола перед использованием. Частицы пыли на гемоцитометре будут окрашены в темно-синий цвет и повлияют на точность теста на жизнеспособность. Проверьте гемоцитометр под микроскопом.
2. Подсчитайте общее число клеток, количество живых клеток (белые) и количество мертвых клеток (темно-синий), окрашенных трипановским синим цветом(рисунок 2,стрелки) соответственно в 4 квадрата с 16 сетками(рисунок 2)с помощью инвертированного микроскопа с системой визуализации.
3. Рассчитайте концентрацию клеток:
   Концентрация в клетках =
   1. Рассчитайте жизнеспособность:
      Жизнеспособность =

Результаты

Отделение эпителия языка от подлежащей мезенхимы/соединительной ткани
В эмбриональном языке мыши виден разрыв в субэпителиальном пространстве после правильного переваривания ферментов. Эпителиальные листы некоторых языков отделяются без механической силы во время инкуб...

Обсуждение

На сегодняшний день не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Этот протокол диссоциации текущих клеток обеспечивает воспроизводимую процедуру для создания одноклеточной суспензии с высокой жизне?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
bovine serum albumin (BSA)	Gold Biotechnology	A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J)	The Jackson Laboratory	000664
collagenase (Collagenase A)	Sigma-Aldrich	10103586001
culture dish (35 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-103G
culture dish (100 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-107G
dispase (Dispase II)	Sigma-Aldrich	04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors)	Find Science Tool	91460-11
DMEM/F12	Gibco	11320033
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps)	Find Science Tool	11293-00
hemocytometer	Hausser Scientific	3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System)	Life Technologies	AMEX1000
low retention pipette tips	METTLER TOLEDO	17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors)	Fine Science Tool	15800-01
plastic warp	VWR	46610-056
spatula (Moria Spoon)	Fine Science Tool	10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps)	Fine Science Tool	11223-20
Trypan blue	Gibco	15250061
Tyrode’s solution	Sigma-Aldrich	T2145-10L	made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA	Gibco	25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Hoefer	33946	made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter	Genesee Scientific	25-243
70% ethanol	Koptec	233919	made from 100% ethanol
1-mL syringe	BD	8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube	Eppendorf	30122348
30-G needle	BD	9193532
35-μm cell strainer	Falcon	64750
70-μm cell strainer	Falcon	64752