Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Zusammenfassung

Ganglioside sind Sialinsäure-tragende Glykosphingolipide, die im Gehirn besonders häufig vorkommen. Ihre amphipathische Natur erfordert organische/wässrige Extraktions- und Reinigungstechniken, um eine optimale Erholung und genaue Analysen zu gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die analytische und präparative Gangliosidextraktion, -reinigung und -chromatographie-Analyse.

Zusammenfassung

Ganglioside sind Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten. Sie kommen auf allen Wirbeltierzellen und -geweben vor, sind aber im Gehirn besonders häufig. Sie werden hauptsächlich auf dem äußeren Blatt der Plasmamembranen von Zellen exprimiert, modulieren die Aktivitäten von Zelloberflächenproteinen durch laterale Assoziation, fungieren als Rezeptoren in Zell-Zell-Interaktionen und sind Ziele für Krankheitserreger und Toxine. Genetische Dysregulation der Gangliosid-Biosynthese beim Menschen führt zu schweren angeborenen Erkrankungen des Nervensystems. Aufgrund ihrer amphipathischen Natur erfordern die Extraktion, Reinigung und Analyse von Gangliosiden Techniken, die von vielen Forschern in den 80 Jahren seit ihrer Entdeckung optimiert wurden. Hier beschreiben wir Methoden auf Laborebene für die Extraktion, Reinigung und vorläufige qualitative und quantitative Analysen der wichtigsten Ganglioside aus Geweben und Zellen, die in wenigen Stunden abgeschlossen werden können. Wir beschreiben auch Methoden zur großflächigen Isolierung und Reinigung der wichtigsten Gangliosidspezies aus dem Gehirn. Zusammen bieten diese Methoden analytischen und präparativen Zugang zu dieser Klasse bioaktiver Moleküle.

Einleitung

Ganglioside sind definiert als Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste ^enthalten1. Sie werden hauptsächlich an der Zelloberfläche exprimiert, wobei ihr hydrophober Ceramidlipidanteil in das äußere Blatt der Plasmamembran eingebettet ist und ihre hydrophilen Glykane sich in den extrazellulären Raum ^erstrecken2. Obwohl sie in Wirbeltierzellen und -geweben weit verbreitet sind, sind sie besonders häufig im Wirbeltiergehirn3^, wo sie zuerst entdeckt und benannt ^wurden4.

Die Strukturen der Gangliosidglykane variieren und bilden die ....

Protokoll

Die Gewebeentnahme erfolgte unter Bedingungen, die vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.

1. Grubengangliosidextraktion in kleinem Maßstab und teilweise Reinigung

ACHTUNG: Verwenden Sie eine angemessene Belüftung, wenn Sie mit flüchtigen und toxischen Lösungsmitteln arbeiten. Vermeiden Sie durchgehend Plastik; Lösungsmittel extrahieren chemische Komponenten aus vielen Kunststoffen, die nachfolgende Analysen stören. Polytetrafluorethylen (PTFE) ist eine Ausnahme; PTFE-ausgekleidete Verschlüsse sollten verwendet werden, um Glasaufbewahrungsfläschchen zu verschließen.

1. Extraktion<....

Ergebnisse

Die in Abschnitt 1 beschriebenen Methoden (kleiner Maßstab) liefern Ganglioside in ausreichender Menge und Reinheit für die qualitative und quantitative Bestimmung der wichtigsten Hirnganglioside. Die Erholung aus dem Gehirn der Maus beträgt ~ 1 μmol Gangliosid pro g Nassgewicht des Gehirns (1 nmol / μL), wenn es wie beschrieben zubereitet wird. Die TLC-Auflösung von 1 μL (1 nmol) unter Verwendung von Abschnitt 3 liefert reichlich Material für den Nachweis von Resorcin und löst alle wichtigen Hirnganglioside auf.......

Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden zur Extraktion und Isolierung von Gangliosid in kleinem und großem Maßstab sind nicht einzigartig - es gibt viele verschiedene Lösungsmittelextraktions- und Reinigungsansätze, die hervorragende Ergebnisse ^liefern12. Die hier berichteten Methoden zur Reinigung in kleinem Maßstab aus dem Gehirn, von Fredman und ^{Svennerholm13}, haben gezeigt, dass sie die Rückgewinnung optimieren und sich über viele Jahre in unserem Labor als robust und un.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine brain, stripped	PelFreez	57105-1
Ganglioside standards	Matreya	GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Glass bottle with PTFE-lined cap	Fisher Scientific	02-911-739
Glass centrifuge bottle	Fisher Scientific	05-586B
Glass culture tubes, 16 x 125 mm	VWR	60825-430	for collecting HPLC fractions
Glass separatory funnel (2 L)	Pyrex	6400-2L
Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl	Hamilton	81265
p-Anisaldehyde, 98%	Sigma-Aldrich	A88107
Potter-Elvhjem Homogenizer	Fisher Scientific	08-414-14A	Choose appropriate volume option
Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns	Analytics-Shop	AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column	Analytics-Shop	custom packed	other sizes available
Resorcinol	Sigma-Aldrich	30752-1
Rotary evaporator	Buchi	R-300
Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)	Sigma-Aldrich	57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)	Waters	WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg	Waters	WAT036810
Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl	Hamilton	80300
Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-933A
Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-955-323	For ganglioside storage
TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat	Fisher Scientific	M1056350001	Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface
TLC reagent sprayer	Fisher Scientific	05-723-26A
TLC running chamber for 10 x 10 cm plates	Camag	22.5155
Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender	Waring	E8520