Экстракция, очистка и профилирование ганглиозидов

Резюме

Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, несущие сиаловую кислоту, которые особенно распространены в головном мозге. Их амфипатическая природа требует органической / водной экстракции и методов очистки для обеспечения оптимального восстановления и точного анализа. В данной статье представлены обзоры аналитической и препаративной ганглиозидной экстракции, очистки и тонкослойного хроматографического анализа.

Аннотация

Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, которые содержат один или несколько остатков сиаловой кислоты. Они встречаются на всех клетках и тканях позвоночных, но особенно распространены в мозге. Экспрессируемые преимущественно на внешнем листочке плазматических мембран клеток, они модулируют активность белков клеточной поверхности через латеральную ассоциацию, действуют как рецепторы в клеточно-клеточных взаимодействиях и являются мишенями для патогенов и токсинов. Генетическая дисрегуляция биосинтеза ганглиозидов у человека приводит к тяжелым врожденным расстройствам нервной системы. Из-за их амфипатической природы извлечение, очистка и анализ ганглиозидов требуют методов, которые были оптимизированы многими исследователями за 80 лет с момента их открытия. Здесь мы описываем настольные методы экстракции, очистки и предварительного качественного и количественного анализа основных ганглиозидов из тканей и клеток, которые могут быть завершены за несколько часов. Мы также описываем методы более масштабного выделения и очистки основных видов ганглиозидов из мозга. Вместе эти методы обеспечивают аналитический и препаративный доступ к этому классу биологически активных молекул.

Введение

Ганглиозиды определяются как гликосфинголипиды, несущие один или несколько остатков сиаловой ^{кислоты1}. Они экспрессируются главным образом на поверхности клетки с их гидрофобным церамидным липидным фрагментом, встроенным во внешний листок плазматической мембраны, и их гидрофильными гликанами, простирающимися во внеклеточное ^{пространство2}. Хотя они широко распространены в клетках и тканях позвоночных, они особенно распространены в мозге позвоночных3, где они были впервые обнаружены и ^{названы4}.

Структуры ганглиозидных гликанов различаются и являются основой для их номенклатуры (рисунок 1). Ганглиозидные гликаны состоят из нейтрального сахарного ядра, несущего различное количество и распределение сиаловых кислот. Самый маленький ганглиозид, GM4, имеет только два сахара (сиаловая кислота, связанная с галактозой)⁵. Более крупные природные ганглиозиды могут содержать более десятка общих ^{сахаров6} или до семи сиаловых кислот на одном нейтральном ядре7. Их керамидные липидные фрагменты также различаются, имея различную длину сфингозина и различные амиды жирных кислот. В мозге позвоночных преобладают четыре вида ганглиозидов, GM1, GD1a, GD1b и GT1b. Экспрессия ганглиозидов регулируется развитием, специфична для тканей и специфична для типа клеток.

Рисунок 1: Основные ганглиозиды мозга и их биосинтетические предшественники. Структуры показаны с использованием номенклатуры символов для ^{гликанов11}. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ганглиозиды функционируют на молекулярном уровне, вовлекая и модулируя белки в своих собственных мембранах (цис-регуляция) или вовлекая гликансвязывающие белки во внеклеточную среду, включая бактериальные токсины и лектины на других клетках (транс-распознавание)³. Специфическое связывание ганглиозидов с регуляторными белками и/или самоассоциация с другими молекулами в липидные рафты приводит к изменениям в поведении клеток, которые влияют на структуру и функцию нервной системы, прогрессирование рака, метаболизм, воспаление, протеинопатии нейронов и инфекционные ^{заболевания8}. Из-за их разнообразных клеточных ролей методы их изоляции и анализа могут обеспечить более глубокое понимание регуляции физиологических и патологических процессов. Здесь представлены проверенные методы быстрой мелкомасштабной экстракции и анализа, а также экстрактивного масштабирования ганглиозидов из мозга. Обсуждаются возможности и проблемы для применения к другим тканям.

протокол

Сбор тканей проводился в условиях, разрешенных Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса.

1. Мелкомасштабная экстракция ганглиозидов и частичная очистка

ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующую вентиляцию при работе с летучими и токсичными растворителями. Избегайте пластика во всем; растворители будут извлекать химические компоненты из многих пластмасс, которые мешают последующим анализам. Политетрафторэтилен (PTFE) является исключением; Укупорочные средства из PTFE следует использовать для закрытия стеклянных флаконов для хранения.

1. Извлечение
   1. Взвесьте один свежий или размороженный мозг мыши (или сагиттальный полумозгойник, ~0,2-0,5 г) и поместите в гомогенизатор Potter-Elvehjem, предварительно охлажденный в ведре со льдом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее замороженные мозги можно использовать после размораживания при 0-4 °C.
   2. Добавляют 4,1 мл на г ткани влажной массы воды и гомогенизируют 10 ударами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точные соотношения растворителей являются ключом к оптимальной экстракции и разделению, целью является хлороформ-метанол-водный (4: 8: 3), предполагая, что ткань мозга на 80% состоит из водных ресурсов.
   3. Добавьте 13 мл на г влажной массы метанола, переведите к температуре окружающей среды (22 °C) и перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение будет выглядеть облачным. Добавление метанола на этом этапе, без хлороформа, оптимизирует осаждение белка. Все последующие этапы проходят при температуре окружающей среды (22 °C).
   4. При температуре окружающей среды (22 °C) переложить на толстостенную стеклянную завинчивающуюся трубку с завинчивающейся крышкой из PTFE и тщательно перемешать. Добавьте 6,5 мл на г влажной массы хлороформа, колпачка и тщательно перемешайте. Центрифуга при 450 х г в течение 15 мин. Перенесите прозрачный супернатант в свежую завинчивающуюся трубку и измерьте объем, «восстановленный объем экстракта».
2. Раздел
   1. Добавить 0,173x "объем восстановленного экстракта" воды к прозрачному супернатанту, колпачку, вихрю энергично и центрифуге, как описано на этапе 1.1.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы хлороформ-метанол-водный в соотношении 4:8:5,6. Смесь будет мутной и распадется на две фазы: верхнюю фазу, богатую водой, и нижнюю фазу, богатую хлороформом, в соотношении ~ 4:1. Подождите 60 мин или центрифуга при 450 х г в течение 15 мин для полного разделения фаз.
   2. Переместите верхнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в свежую стеклянную трубку с винтовой крышкой из PTFE.
3. Хроматография картриджа обратной фазы
   1. Используя стеклянный шприц объемом 5 мл, промыть твердофазный экстракционный картридж tC18 (400 мг) 3 мл метанола, затем 3 мл хлороформа-метанола-воды (2:43:55). Загрузите верхнюю фазу с шага 1.2.2 на картридж tC18 с помощью того же стеклянного шприца, соберите сквозной поток и перезагрузите его на колонну для оптимизации адсорбции.
   2. Используя стеклянный шприц, промыть картридж 3 мл хлороформ-метанол-воды (2:43:55), затем 3 мл метанол-воды (1:1).
   3. Элюируйте ганглиозиды 3 мл метанола в свежую завинчивающуюся трубку. Испаряется до сухости под мягким потоком азота при ≤ 45 °C. Растворяют в метаноле по 1 мл на г исходной ткани влажной массы.

2. Крупномасштабная экстракция и очистка ганглиозидов

ВНИМАНИЕ: При работе с летучими растворителями используйте взрывозащищенные блендеры. Не используйте пластмассы, кроме PTFE. Тетрагидрофуран, хлороформ и этиловый эфир являются токсичными летучими органическими соединениями. Работайте в вытяжном капюшоне с защитными перчатками и защитными очками.

1. Извлечение
   1. Разморозить замороженный бычий мозг при 4 °C в течение нескольких часов. Рассекайте серое вещество от мозговых оболочек и белого вещества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура описана для 100 ± 20 г изолированного серого вещества мозга и является масштабируемой.
   2. Поместите 100 г серого вещества мозга в блендер и добавьте 1 мл на г влажной массы мозга охлажденного 10 мМ буфера фосфата калия pH 6,8. Гомогенизировать на низком уровне в течение 20 с. Добавьте 8 мл тетрагидрофурана на г живого веса мозга и гомогенизируйте на низком уровне в течение 10 с. Декантировать в стеклянные бутылки-центрифуги и центрифугу при 5 000 х г в течение 15 мин при температуре окружающей среды (22 °C).
   3. Соберите супернатант, измерьте его объем и переложите в стеклянную сепараторную воронку. Добавьте 0,3 мл этилового эфира на мл надосадочного вещества. Энергично встряхните, затем дайте спокойно постоять в течение 30 минут, в течение которых две фазы, верхняя эфирная фаза и нижняя водная фаза, разделяются. Соберите нижнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в стеклянную бутылку с крышкой из PTFE.
   4. К верхней (эфирной) фазе, остающейся в сепараторной воронке, добавляют 0,1 мл воды на мл исходного супернатанта (этап 2.1.3). Энергично встряхните, дайте фазам разделиться, соберите нижнюю (водную) фазу и соедините с предыдущей нижней фазой. Испарите комбинированные нижние фазы в сухой порошок и взвесьте.
2. Омыление
   1. Добавить 10 мл 100 мМ водного NaOH на г порошка в герметичный тюбик. Перемешать и инкубировать при 37 °C в течение 3 ч. Дайте остыть и отрегулировать до рН 4,5 путем по каплего добавления 100 мМ водного раствора HCl. Измерьте объем и перенесите в стеклянную сепарационную воронку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сиаловые кислоты являются кислотными лабильными; избегать подкисления ниже рН 4,5.
   2. Исходя из водного объема, добавьте 2,67 объема метанола, аккуратно перемешайте, затем добавьте 1,33 объема хлороформа для создания однофазного раствора хлороформ-метанол-водный (4:8:3). Хорошо перемешать.
   3. Исходя из исходного водного объема, добавьте 2,6 объема воды, чтобы довести смесь до хлороформ-метанол-водного раствора в соотношении 4:8:5,6. Энергично встряхните, затем дайте спокойно сесть, чтобы разделить две фазы, полярную верхнюю фазу, содержащую ганглиозиды, и неполярную нижнюю фазу. Соберите верхнюю фазу в стеклянную бутылку с крышкой из PTFE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несиалилированные липиды не будут появляться на тонкослойных хроматографических пластинах (TLC), окрашенных с использованием резорцина, но будут появляться при использовании пятна p-анизальдегида. Целью этого омыления является удаление О-ацетилированных соединений, таких как фосфолипиды.
3. Обратная фазовая хроматография
   1. Предварительно промыть крупномасштабную (10 г) твердофазную экстракционную картридж tC18 путем пропускания 50 мл каждого из следующих трех растворителей через колонну с использованием вакуума или давления (<1 мин каждая промывка): метанол, метанол-вода (1:1), затем хлороформ-метанол-вода (2:43:55). Загрузите верхнюю фазу с шага 2.2.3 на колонну вакуумом или давлением, соберите поток, перезагрузите и соберите поток.
   2. Промыть колонну 30 мл хлороформ-метанол-воды (2:43:55), затем 30 мл метанол-воды (1:1), затем элюировать ганглиозиды 50 мл метанола и снова 10 мл метанола, собирая каждую промывку и каждое элюирование отдельно. Использование TLC (ниже) подтверждает, что ганглиозид отсутствует в потоке и промывается и элюируется при первом элюировании (50 мл метанола). Выпаривают элюированные ганглиозиды в сухой порошок и взвешивают.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целью хроматографии tC18 является отделение ганглиозидов как от меньшего, так и от большего количества полярных загрязнителей. Смешанный выход ганглиозидов головного мозга после омыления составляет ~ 120 мг на г сухого экстракта мозга (этап 2.1.4). Появление ганглиозидов TLC в потоке или промывках указывает на то, что твердофазная экстракционная колонна была насыщена. После элюирования метанола колонку можно дополнительно элюировать хлороформом-метанолом (1:1) для захвата меньшего количества полярных липидов.
4. ВЭЖХ очистка отдельных ганглиозидов
   1. Получают ВЭЖХ растворитель А: ацетонитрил-5 мМ водный натрийфосфатный буфер рН 5,6 (83:17) и растворитель В: ацетонитрил-20 мМ натриефосфатный буфер, рН 5,6 (1:1). Дегазировать оба растворителя в течение 5 мин.
   2. Предварительно уравновешивайте колонну ВЭЖХ (колонна размером 20 x 250 мм, заполненная амино-связанными (_NH2) кремнеземными сферами, диаметром 5 мкм, размером пор 100 Å) со 100% растворителем А в течение 20 мин при 5 мл/мин. Установите столбчатый детектор сточных вод УФ-ВЭЖХ на 215 нм.
   3. Растворить ганглиозидный порошок из элюата обратной фазы в воде по 5 мг/мл. Вводят 0,5 мл ганглиозидной смеси на ВЭЖХ и запускают градиент растворителя (таблица 1) со скоростью 5 мл/мин, собирая фракции. Ганглиозиды будут появляться в виде пиков _A215 со временем удержания (основные ганглиозиды мозга) 25-70 мин: GM1 ≈ 28 мин; GD1a ≈ 38 мин; GD1b ≈ 46 мин; GT1b ≈ 65 мин. Повторно уравновешивайте 20 мин растворителем А после каждого прогона. Анализ фракций методом тонкослойной хроматографии.

Время (мин)	%А	%В
0	100	0
7	100	0
12	63	37
82	54	46
82.01	0	100
92	0	100

Таблица 1: Градиент растворителя для ВЭЖХ.

3. Тонкослойный хроматографический (TLC) анализ ганглиозидов

ВНИМАНИЕ: Хлороформ является токсичным летучим органическим соединением. Работайте в вытяжном капюшоне с защитными перчатками и защитными очками.

1. Запуск растворителя и подготовки пластин TLC
   1. Готовят работающий растворитель хлороформ-метанол-водный 0,25% KCl (60:35:8 по объему). Перелейте в стеклянную камеру TLC размером 10 см х 10 см с крышкой из нержавеющей стали так, чтобы глубина растворителя составляла ~ 0,5 см. Накройте крышкой и дайте уравновеситься в зоне, свободной от воздушных потоков в течение >10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изолировать камеру TLC от воздушных потоков, можно построить или приобрести акриловую 5-стороннюю коробку (рисунок 2). Не используйте фильтровальную бумагу, насыщенную растворителем, внутри камеры.
   2. Поместите в сушильную печь со стеклянной пластиной TLC размером 10 см x 10 см или 5 см x 10 см со стеклянной подложкой в сушильную печь при 125 °C в течение 10 минут. Дать остыть. Используйте притупленный карандаш No 2, чтобы нарисовать 5-миллиметровые пятнистые линии с разделением 2 мм вдоль линии на 1 см выше нижней части пластины и не менее 1 см с обеих сторон (рисунок 3). Избегайте нарушения слоя кремнезема во время маркировки.
   3. Приготовьте стандартную смесь чистых ганглиозидов в метаноле, содержащую 100 мкМ GM1, 50 мкМ GD1a и GD1b и 33 мкМ GT1b.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь содержит 100 пмоль ганглиозидной сиаловой кислоты на мкл для каждого из четырех ганглиозидов, количество, которое обеспечивает сильный колориметрический сигнал путем окрашивания резорцином, которое зависит от сиаловой кислоты.
2. Ганглиозидное разрешение
   1. Промыть 10-мкл шприц Гамильтона скошенной иглой с метанолом. Втяните 1 мкл метанола в стеклянный шприц, чтобы заполнить мертвый объем иглы, а затем 1 мкл образца или стандарта. Равномерно нанесите образец на 5-миллиметровые предварительно маркированные линии до тех пор, пока в шприце не останется <1 мкл растворителя (метанола). Дайте пластине высохнуть при температуре окружающей среды (22 °C) после обнаружения всех образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывайте шприц метанолом между загрузками образца. Ненагретый воздуходувка, установленная на низком уровне, может использоваться для ускорения сушки.
   2. Поместите пятнистую и высушенную пластину в предварительно уравновешенную камеру TLC с нижним краем, погруженным в работающий растворитель, и накройте крышкой и защитите от воздушных потоков (рисунок 2). Позвольте работающему растворителю продвинуться вверх по пластине капиллярным действием до тех пор, пока передняя часть растворителя не достигнет в пределах 1 см от верхней части пластины. Снимите и пометьте карандашом переднюю часть растворителя по краю пластины. Позвольте растворителям полностью испаряться либо без помех, либо под мягким потоком воздуха.

Рисунок 2: Оборудование и настройка ганглиозида TLC. Двойная желобная камера заполняется до ≈ 0,5 см с обеих сторон бегущим растворителем. Пластина размещается с одной стороны, а исходный конец погружен в работающий буфер. Камера покрыта акриловой коробкой, чтобы избежать воздушных потоков. Панель A, вид сбоку перед установкой пластины. Уровень растворителя виден на несколько мм выше дна камеры; Панель B, вид спереди во время разработки. Передняя часть растворителя видна примерно на 40% пути вверх по пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Окрашивание ганглиозидами
   ВНИМАНИЕ: Реагентные пятна токсичны. Соляная кислота коррозионна и токсична. Подготовьте и распылите реагенты в вытяжной капюшон с защитными перчатками и защитными очками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина может быть отображена для качественного анализа изображения или сохранена путем снятия зажимов и закрепления крышки на месте с помощью прозрачной ленты. Количественный анализ может быть выполнен путем измерения денситометрии стандартов ганглиозидов, обнаруженных в соседних полосах.
   1. Приготовьте реагент спрей реагента для обнаружения ганглиозидов на основе их сиаловых кислот. Растворите 6 г резорцина в воде объемом 100 мл для получения 6% запаса резорцина. Растворите 1 г _CuSO4 в 100 мл воды, чтобы получить 1% запаса. К 64,7 мл воды добавляют 5 мл из 6% запаса резорцина, 0,31 мл из 1% запаса _CuSO4 , затем медленно добавляют 30 мл концентрированного HCl и осторожно перемешивают. Можно хранить при температуре 4 °C в течение месяца.
   2. В вытяжку с химическим дымом поместите пластину TLC с разрешенными ганглиозидами, происхождение которых заканчивается, в вырезанную картонную коробку, чтобы защитить стенки вытяжки от кислотного распыления. Поместите реагент реагента с распылением резорцина в стеклянный распылитель TLC, прикрепите к источнику азота под давлением и слегка распылите пластину по диагонали в вертикальном и горизонтальном направлениях. Распылите поверхность сорбента TLC равномерно, но слегка.
   3. Сразу же накройте пластину чистой сухой стеклянной крышкой тех же размеров и закрепите крышку на месте связующими зажимами (рисунок 3). Нагревайте покрытую пластину при 125 °C в течение 20 мин. Ганглиозиды будут казаться темно-фиолетовыми на белом фоне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина не должна быть влажной после завершения распыления. Накладные пластины могут быть изготовлены путем соскабливания сорбента с ранее использовавшихся пластин TLC с использованием лезвия бритвы с одним лезвием.
      ВНИМАНИЕ: Порошок кремнезема токсичен для легких. Используйте маску и утилизируйте кремнезем в герметичный контейнер.

Рисунок 3: Пластина TLC из разрешенного смешанного ганглия. Пластина TLC из разрешенных смешанных стандартов ганглиозидов (левая полоса) и очищенных смешанных ганглиозидов серого вещества крупного рогатого скота (правая полоса) после окрашивания и нагрева резорцина стеклянной крышкой, обрезанной на месте. Стандартными ганглиозидами (сверху вниз) являются GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b и GQ1b. После охлаждения пластина может быть изображена и/или крышка заклеена на месте для хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Общее окрашивание липидов для ганглиозидов и фосфолипидов.
   ВНИМАНИЕ: Серная кислота токсична и коррозионна. Добавление концентрированной кислоты к этанолу является экзотермическим и должно осуществляться медленно. Подготовьте окрашивающий реагент в вытяжной капюшон с защитными перчатками и защитными очками.
   1. Готовят р-анизальдегидное пятно, медленно добавляя 15 мл концентрированной серной кислоты к 500 мл этанола. Перемешивайте в течение 30 минут, чтобы дать раствору остыть, прежде чем продолжить. Добавить 15 мл п-анизальдегида и осторожно перемешать. Его можно хранить при комнатной температуре (22 °C) до шести месяцев.
   2. В химическом вытяжном шкафу опустите пластину TLC с разрешенными ганглиозидами, происхождение которых заканчивается вниз, в стакан, содержащий пятно p-анизальдегида. Погружайтесь в беговую переднюю часть на ≥ 2 с. Удалите TLC из пятна и дайте стекать. Нагревайте пластину TLC на конфорке при низкой температуре для развития.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Липиды будут казаться темными на фиолетовом фоне. Окрашивающий раствор может быть восстановлен для повторного использования.

Результаты

Методы, описанные в разделе 1 (малый масштаб), обеспечивают ганглиозиды в достаточном количестве и чистоте для качественного и количественного определения основных ганглиозидов мозга. Восстановление из мозга мыши составляет ~ 1 мкмоль ганглиозида на г влажного веса мозга (1 нмоль / мкл) п...

Обсуждение

Методы мелкой и крупномасштабной экстракции и выделения ганглиозидов, о которых здесь сообщается, не являются уникальными - существует множество различных подходов к экстракции и очистке растворителем, которые обеспечивают отличные ^{результаты12}. Методы, описанные здесь д...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine brain, stripped	PelFreez	57105-1
Ganglioside standards	Matreya	GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Glass bottle with PTFE-lined cap	Fisher Scientific	02-911-739
Glass centrifuge bottle	Fisher Scientific	05-586B
Glass culture tubes, 16 x 125 mm	VWR	60825-430	for collecting HPLC fractions
Glass separatory funnel (2 L)	Pyrex	6400-2L
Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl	Hamilton	81265
p-Anisaldehyde, 98%	Sigma-Aldrich	A88107
Potter-Elvhjem Homogenizer	Fisher Scientific	08-414-14A	Choose appropriate volume option
Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns	Analytics-Shop	AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column	Analytics-Shop	custom packed	other sizes available
Resorcinol	Sigma-Aldrich	30752-1
Rotary evaporator	Buchi	R-300
Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)	Sigma-Aldrich	57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)	Waters	WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg	Waters	WAT036810
Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl	Hamilton	80300
Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-933A
Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-955-323	For ganglioside storage
TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat	Fisher Scientific	M1056350001	Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface
TLC reagent sprayer	Fisher Scientific	05-723-26A
TLC running chamber for 10 x 10 cm plates	Camag	22.5155
Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender	Waring	E8520