Extração de ganglioside, purificação e perfil

Resumo

Gangliosides são glicósfoliópidos portadores de ácido sálico que são particularmente abundantes no cérebro. Sua natureza anfíppática requer técnicas orgânicas/aquosas de extração e purificação para garantir uma recuperação ideal e análises precisas. Este artigo fornece visões gerais da extração de ganglioside em escala analítica e preparatória, purificação e análise de cromatografia de camada fina.

Resumo

Gangliosides são glicosfingolipidos que contêm um ou mais resíduos de ácido sálico. Eles são encontrados em todas as células vertebrados e tecidos, mas são especialmente abundantes no cérebro. Expressos principalmente no folheto externo das membranas plasmáticas das células, eles modulam as atividades das proteínas da superfície celular via associação lateral, atuam como receptores nas interações células-células e são alvos de patógenos e toxinas. A desregulação genética da biossíntese ganglioside em humanos resulta em graves distúrbios do sistema nervoso congênito. Devido à sua natureza anfípppica, a extração, a purificação e a análise de gangliosides exigem técnicas que foram otimizadas por muitos investigadores nos 80 anos desde sua descoberta. Aqui, descrevemos métodos de nível de bancada para a extração, purificação e análises qualitativas e quantitativas preliminares de grandes gangliosides de tecidos e células que podem ser completadas em poucas horas. Também descrevemos métodos para isolamento em maior escala e purificação de grandes espécies de ganglioside do cérebro. Juntos, esses métodos proporcionam acesso analítico e de escala preparatória a essa classe de moléculas bioativas.

Introdução

Os gangliosides são definidos como glicosfingolipids com um ou mais resíduos de ácido ^sálico1. Eles são expressos principalmente na superfície celular com sua moiety lipídica de ceramida hidrofóbica incorporada no folheto externo da membrana plasmática e seus glicanos hidrofílicos estendendo-se para o espaço extracelular2. Embora amplamente distribuídas em células vertebradas e tecidos, elas são particularmente abundantes no cérebro ^vertebrado3, onde foram descobertos pela primeira vez e ^nomeados4.

As estruturas dos glicanos gangliosas variam e s....

Protocolo

A coleta de tecidos foi realizada em condições autorizadas pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins.

1. Extração de ganglioside em pequena escala e purificação parcial

ATENÇÃO: Tenha ventilação adequada ao trabalhar com solventes voláteis e tóxicos. Evite o plástico por toda parte; solventes extrairão componentes químicos de muitos plásticos que interferem com análises subsequentes. Politetrafluoroetileno (PTFE) é uma exceção; Os fechamentos alinhados ao PTFE devem ser usados para tampar frascos de armazenamento de vidro.

1. Extração
   1. Pesar um único cérebro de rato fresco ou desc....

Resultados

Os métodos descritos na seção 1 (pequena escala) fornecem gangliosides em quantidade e pureza suficientes para a determinação qualitativa e quantitativa de grandes lesões cerebrais. A recuperação do cérebro do camundongo é ~ 1 μmol ganglioside por g peso molhado cerebral (1 nmol/μL) quando preparado como descrito. A resolução TLC de 1 μL (1 nmol) usando a seção 3 fornece material amplo para detecção de resorcinol e resolve todos os principais gangliodolos cerebrais como mostrado para o tipo selvagem e .......

Discussão

Os métodos de extração e isolamento de ganglioside de pequeno e grande porte relatados aqui não são únicos - existem muitas abordagens diferentes de extração e purificação de solventes que fornecem excelentes ^resultados12. Os métodos relatados aqui para purificação em pequena escala do cérebro, de Fredman e ^{Svennerholm13}, mostraram-se para otimizar a recuperação e provaram ser robustos e diretos ao longo de muitos anos em nosso laboratório. O isolamento e p.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine brain, stripped	PelFreez	57105-1
Ganglioside standards	Matreya	GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Glass bottle with PTFE-lined cap	Fisher Scientific	02-911-739
Glass centrifuge bottle	Fisher Scientific	05-586B
Glass culture tubes, 16 x 125 mm	VWR	60825-430	for collecting HPLC fractions
Glass separatory funnel (2 L)	Pyrex	6400-2L
Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl	Hamilton	81265
p-Anisaldehyde, 98%	Sigma-Aldrich	A88107
Potter-Elvhjem Homogenizer	Fisher Scientific	08-414-14A	Choose appropriate volume option
Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns	Analytics-Shop	AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column	Analytics-Shop	custom packed	other sizes available
Resorcinol	Sigma-Aldrich	30752-1
Rotary evaporator	Buchi	R-300
Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)	Sigma-Aldrich	57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)	Waters	WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg	Waters	WAT036810
Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl	Hamilton	80300
Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-933A
Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-955-323	For ganglioside storage
TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat	Fisher Scientific	M1056350001	Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface
TLC reagent sprayer	Fisher Scientific	05-723-26A
TLC running chamber for 10 x 10 cm plates	Camag	22.5155
Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender	Waring	E8520