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Hier wird ein Protokoll für einen Kapillarelektrophorese-basierten Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX)-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-Massenspektrometrie vorgestellt. Dieser Ansatz charakterisiert den Unterschied in Strukturen höherer Ordnung zwischen verschiedenen Proteinspezies, einschließlich Proteinen in verschiedenen Zuständen und verschiedenen Proteoformen, indem er gleichzeitig differentielle HDX- und elektrophoretische Trennung durchführt.
Die Auflösung der Konformationsheterogenität mehrerer Proteinzustände, die in Lösung koexistieren, bleibt eines der Haupthindernisse bei der Charakterisierung von Proteintherapeutika und der Bestimmung der für biologische Funktionen kritischen Konformationsübergangswege, die von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse reichen. Die Reaktion auf Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX) in Verbindung mit der top-down-Massenspektrometrie (MS) bietet ein Mittel, um Proteinstrukturen und -dynamiken höherer Ordnung konformitätsspezifisch zu charakterisieren. Das Konformationsauflösungsvermögen dieser Technik hängt stark von den Wirkungsgraden der Trennung von Proteinzuständen auf intakter Proteinebene und der Minimierung des verbleibenden nicht deuterierten Protikgehalts während der HDX-Reaktionen ab.
Hier beschreiben wir eine auf Kapillarelektrophorese (CE) basierende Variante des HDX MS-Ansatzes, die darauf abzielt, die Konformationsauflösung zu verbessern. Bei diesem Ansatz durchlaufen Proteine HDX-Reaktionen, während sie während der kapillaren elektrophoretischen Trennung durch eine deuterierte Hintergrundelektrolytlösung (BGE) wandern. Verschiedene Proteinzustände oder Proteoformen, die in Lösung koexistieren, können aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladungs-zu-Größe-Verhältnisse effizient getrennt werden. Der Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität zwischen Proteinen und protischen Lösungsmittelmolekülen minimiert das verbleibende nicht deuterierte Lösungsmittel, was zu einer nahezu vollständigen Deuterationsumgebung während des HDX-Prozesses führt. Die durchströmende mikroviale CE-MS-Grenzfläche ermöglicht eine effiziente Elektrosprayionisation der eluierten Proteinspezies nach einer schnellen Vermischung mit der Abschreck- und Denaturierungsmodifikatorlösung am Ausgang des Sprühgeräts. Die Online-Top-Down-MS-Analyse misst das globale Deuterationsniveau der eluierten intakten Proteinspezies und anschließend die Deuteration ihrer Gasphasenfragmente. Dieses Papier demonstriert diesen Ansatz in differentiellem HDX für Systeme, einschließlich der natürlichen Proteinvarianten, die in Milch koexistieren.
Die Unterscheidung von Proteinspezies in verschiedenen Konformations-, Bindungs- oder Modifikationszuständen und die Charakterisierung ihrer strukturellen Unterschiede sind wichtig, um die Wege der Übergänge zwischen diesen Spezies zu überwachen, die an biologischen Ereignissen beteiligt sind, von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse, und um die Mechanismen zu verstehen, die diesen Ereignissen zugrunde liegen. Herkömmliche biophysikalische Techniken bieten aufgrund der Einschränkungen wie unzureichende Auflösung und Verlust dynamischer Informationen in der Lösung keine vollständige Lösung. Der Wasserstoff/Deuterium-Austausch in Verbindung mit der M....
HINWEIS: Verwenden Sie nach Möglichkeit Hochleistungsreagenzien in Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder MS-Qualität, um die Verunreinigungen zu minimieren, die die MS-Analyse beeinträchtigen können. Berühren Sie die CE-MS-Schnittstelle während der Messung nicht mit bloßen Händen, um die Möglichkeit eines elektrischen Schlags zu vermeiden, der entweder durch die elektrophoretische Spannung oder die Elektrosprayspannung verursacht wird.
1. Materialaufbereitung
Die Änderung des Infusionsdrucks von BGE ermöglicht die Einstellung sowohl der Abscheideeffizienz als auch der Migrationszeit, die der HDX-Reaktionszeit der zu trennenden Proteine entspricht (Abbildung 3). Ein niedrigerer Infusionsdruck führt zu einer besseren Trennung der CE-Spitzen auf Kosten der Dauer des Experiments (Abbildung 3A). Eine längere Migrations-/HDX-Reaktionszeit führt zu einer höheren Deuteration der Proteinanalyten (Ab.......
Zu den Zielen der Beschichtung der Innenwand der CE-Kapillare gehören die Minimierung des elektroosmotischen Flusses und die Proteinabsorption während des CE-Prozesses13. Obwohl der elektroosmotische Fluss für die konventionelle CE-Analyse kleiner Moleküle von Vorteil ist, da er neutrale oder entgegengesetzt geladene Spezies zum Detektor treiben kann, beeinträchtigt er die Trenneffizienz von Proteinspezies mit ähnlichen Größen und Nettoladungen in Lösung. Die Beschichtung der Kapillare mi.......
D. D. Y. Chen ist einer der Gründer des Knowledge for Health Institute for Biomolecules, das die mikrofläuliche CE-MS-Schnittstelle kommerzialisiert. Andere Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069) unterstützt. Die Autoren erhielten auch Unterstützung vom Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center für biomedizinische Funktionsmaterialien; und Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials an der Nanjing Normal University, China.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 |
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