Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für einen Kapillarelektrophorese-basierten Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX)-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-Massenspektrometrie vorgestellt. Dieser Ansatz charakterisiert den Unterschied in Strukturen höherer Ordnung zwischen verschiedenen Proteinspezies, einschließlich Proteinen in verschiedenen Zuständen und verschiedenen Proteoformen, indem er gleichzeitig differentielle HDX- und elektrophoretische Trennung durchführt.

Zusammenfassung

Die Auflösung der Konformationsheterogenität mehrerer Proteinzustände, die in Lösung koexistieren, bleibt eines der Haupthindernisse bei der Charakterisierung von Proteintherapeutika und der Bestimmung der für biologische Funktionen kritischen Konformationsübergangswege, die von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse reichen. Die Reaktion auf Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX) in Verbindung mit der top-down-Massenspektrometrie (MS) bietet ein Mittel, um Proteinstrukturen und -dynamiken höherer Ordnung konformitätsspezifisch zu charakterisieren. Das Konformationsauflösungsvermögen dieser Technik hängt stark von den Wirkungsgraden der Trennung von Proteinzuständen auf intakter Proteinebene und der Minimierung des verbleibenden nicht deuterierten Protikgehalts während der HDX-Reaktionen ab.

Hier beschreiben wir eine auf Kapillarelektrophorese (CE) basierende Variante des HDX MS-Ansatzes, die darauf abzielt, die Konformationsauflösung zu verbessern. Bei diesem Ansatz durchlaufen Proteine HDX-Reaktionen, während sie während der kapillaren elektrophoretischen Trennung durch eine deuterierte Hintergrundelektrolytlösung (BGE) wandern. Verschiedene Proteinzustände oder Proteoformen, die in Lösung koexistieren, können aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladungs-zu-Größe-Verhältnisse effizient getrennt werden. Der Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität zwischen Proteinen und protischen Lösungsmittelmolekülen minimiert das verbleibende nicht deuterierte Lösungsmittel, was zu einer nahezu vollständigen Deuterationsumgebung während des HDX-Prozesses führt. Die durchströmende mikroviale CE-MS-Grenzfläche ermöglicht eine effiziente Elektrosprayionisation der eluierten Proteinspezies nach einer schnellen Vermischung mit der Abschreck- und Denaturierungsmodifikatorlösung am Ausgang des Sprühgeräts. Die Online-Top-Down-MS-Analyse misst das globale Deuterationsniveau der eluierten intakten Proteinspezies und anschließend die Deuteration ihrer Gasphasenfragmente. Dieses Papier demonstriert diesen Ansatz in differentiellem HDX für Systeme, einschließlich der natürlichen Proteinvarianten, die in Milch koexistieren.

Einleitung

Die Unterscheidung von Proteinspezies in verschiedenen Konformations-, Bindungs- oder Modifikationszuständen und die Charakterisierung ihrer strukturellen Unterschiede sind wichtig, um die Wege der Übergänge zwischen diesen Spezies zu überwachen, die an biologischen Ereignissen beteiligt sind, von der molekularen Erkennung bis zur enzymatischen Katalyse, und um die Mechanismen zu verstehen, die diesen Ereignissen zugrunde liegen. Herkömmliche biophysikalische Techniken bieten aufgrund der Einschränkungen wie unzureichende Auflösung und Verlust dynamischer Informationen in der Lösung keine vollständige Lösung. Der Wasserstoff/Deuterium-Austausch in Verbindung mit der M....

Protokoll

HINWEIS: Verwenden Sie nach Möglichkeit Hochleistungsreagenzien in Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder MS-Qualität, um die Verunreinigungen zu minimieren, die die MS-Analyse beeinträchtigen können. Berühren Sie die CE-MS-Schnittstelle während der Messung nicht mit bloßen Händen, um die Möglichkeit eines elektrischen Schlags zu vermeiden, der entweder durch die elektrophoretische Spannung oder die Elektrosprayspannung verursacht wird.

1. Materialaufbereitung

1. Modifikation der Kapillare für Quarzglas für CE
   1. Eine 5%ige (w/w) Hydroxypropylcellulose (HPC)-Lösung wird hergestellt, indem HPC-Pulver (Molekulargewicht [MW]: 100 ....

Ergebnisse

Die Änderung des Infusionsdrucks von BGE ermöglicht die Einstellung sowohl der Abscheideeffizienz als auch der Migrationszeit, die der HDX-Reaktionszeit der zu trennenden Proteine entspricht (Abbildung 3). Ein niedrigerer Infusionsdruck führt zu einer besseren Trennung der CE-Spitzen auf Kosten der Dauer des Experiments (Abbildung 3A). Eine längere Migrations-/HDX-Reaktionszeit führt zu einer höheren Deuteration der Proteinanalyten (Ab.......

Diskussion

Zu den Zielen der Beschichtung der Innenwand der CE-Kapillare gehören die Minimierung des elektroosmotischen Flusses und die Proteinabsorption während des CE-Prozesses¹³. Obwohl der elektroosmotische Fluss für die konventionelle CE-Analyse kleiner Moleküle von Vorteil ist, da er neutrale oder entgegengesetzt geladene Spezies zum Detektor treiben kann, beeinträchtigt er die Trenneffizienz von Proteinspezies mit ähnlichen Größen und Nettoladungen in Lösung. Die Beschichtung der Kapillare mi.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ammonium acetate	Fisher Chemical	A/3446/50	≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system	Sciex, USA
centrifuge	Eppendorf	5406000097
centrifugal filter	Merck	UFC201024	10 kDa cutoff
deuterium oxide	Energy Chemical	E090001	99.9 % D
formic acid	Acros Organics	270480250
fused silica glass capillary	Polymicro Technologies	1068150017	ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography	Agilent	GC6890N
hydrochloric acid	Sigma Aldrich	258148
hydroxypropyl cellulose	Aladdin	H113415	MW 100000
magnetic stirrers	DLAB	8030101212
methanol	Fisher Chemical	A456-4	MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer	DeNovix	84677JK7731
myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System	Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
ubiquitin	Sigma Aldrich	U6253
ultrasonicator	SCIENTZ	SB-5200
β-lactoglobulin	Sigma Aldrich	L0130