Quantitative Beurteilung der Macropinozytose in mTORC1-hyperaktiven Zellen mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet experimentelle Werkzeuge zur Bewertung der makropinozytären Aufnahme von Nährstoffen (Kohlenhydrate und Proteine) durch mTORC1-hyperaktive Zellen. Detaillierte Schritte zur Quantifizierung der Aufnahme von fluoreszenzmarkiertem Dextran und Rinderserumalbumin (BSA) werden beschrieben.

Zusammenfassung

Die Macropinozytose ist ein hochkonservierter, aktinabhängiger endozytärer Prozess, der die Aufnahme von extrazellulärem Material, einschließlich Proteinen und Lipiden, ermöglicht. In proliferierenden Zellen kann die Makropinozytose extrazelluläre Nährstoffe an das Lysosom liefern, die zu kritischen Makromolekül-Bausteinen verarbeitet werden. Jüngste Studien haben die Abhängigkeit mehrerer Krebsarten von der Makropinozytose hervorgehoben, darunter Brust-, Darm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Es wird angenommen, dass Ras-Mutationen die treibenden Kräfte hinter der Initiierung der Makropinozytose sind, die zur Aktivierung zellulärer anaboler Prozesse über den mTORC1-Signalweg führen. Interessanterweise kann mTORC1 auch unabhängig von Ras durch Makropinozytose aktiviert werden. Daher stellt die Makropinozytose eine metabolische Schwachstelle dar, die genutzt werden kann, um makropinozytäre Tumoren zu bekämpfen, indem ihr Zugang zu Nährstoffen therapeutisch eingeschränkt wird.

Beim tuberösen Sklerose-Komplex (TSC) und bei der Lymphangioleiomyomatose (LAM) führt die mTORC1-Hyperaktivierung zu einer verstärkten Makropinozytose und metabolischen Reprogrammierung. In dieser Arbeit beschreiben wir ein durchflusszytometrisches Protokoll zur quantitativen Beurteilung der Makropinozytose in Säugetierzellen. Es werden TSC2-defiziente MEFs verwendet, die eine aberrante Aktivierung von mTORC1 aufweisen und im Vergleich zu TSC2-exprimierenden Zellen eine erhöhte Makropinozytose aufweisen. Zellen, die mit pharmakologischen Inhibitoren der Makropinozytose behandelt werden, werden mit fluoreszenzmarkiertem, lysinfixierbarem, 70 kDa Dextran oder fluoreszenzmarkiertem Rinderserumalbumin (BSA) inkubiert, das durch Durchflusszytometrie untersucht wird. Bisher wurden robuste bildbasierte Techniken entwickelt, um die Makropinozytose in Tumorzellen in vitro und in vivo quantitativ zu beurteilen. Diese Analyse ermöglicht eine quantitative Beurteilung der Makropinozytose unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und ergänzt bestehende bildbasierte Techniken.

Einleitung

Die Macropinozytose ist ein endozytärer Prozess, der sich der Massenaufnahme von extrazellulärem Material widmet, gefolgt von der Bildung von Makropinosomen, die entweder an die Plasmamembran zurückgeführt werden oder mit Lysosomen fusionieren, um die internalisierte Fracht abzubauen ^1,2. Obwohl die Ladungsaufnahme nicht selektiv ist, ist die Makropinozytose ein mehrstufiger Prozess, der durch Rab-GTPasen und Membranphospholipide streng reguliert wird ^3,4. Insbesondere Krebszellen nutzen die Makropinozytose, um extrazelluläre Nährstoffe wie Proteine, Polysaccharide und Lipide zu internalisieren. Die Macropinozytose in Krebszellen wird durch Onkogene stromabwärts von Ras oder v-Src als Mechanismus zur Unterstützung ihrer Proliferation aktiviert, insbesondere unter Nährstoffstressbedingungen ^5,6. Daher stellt die Makropinozytose einen neuen therapeutischen Ansatz dar, um Krebszellen durch Unterbrechung der Nährstoffaufnahmewege zu bekämpfen ^7,8.

Beim tuberösen Sklerose-Komplex (TSC) und der Lymphangioleiomyomatose (LAM) führt der Funktionsverlust von Mutationen in TSC1 oder TSC2 zu einer Hyperaktivierung des säugetierlichen/mechanistischen Ziels des Rapamycin-Komplexes 1 (mTORC1)⁹. Es ist bekannt, dass eine aberrante mTORC1-Aktivierung eine umfangreiche metabolische Reprogrammierung antreibt, einschließlich der Aufnahme und Verwertung von Glukose und Glutamin, einer verbesserten Nukleinsäuresynthese, Lipidsynthese und Autophagie^10,11. Um diesen erhöhten anabolen Bedarf zu kompensieren, erhöhen mTORC1-hyperaktive Zellen die Aufnahme exogener Nährstoffe über die Makropinozytose und verstärken den lysosomalen Abbau der internalisierten Fracht¹². In neueren Arbeiten haben wir Ritanserin, einen Inhibitor der Diacylglycerinkinase alpha (DGKA), als Wirkstoff identifiziert, der selektiv die Proliferation von TSC2-defizienten Zellen hemmt¹³. DGKA ist eine Lipidkinase, die Diacylglycerin zu Phosphatidsäure (PA)¹⁴ metabolisiert. PA ist ein wichtiges Botenstoffmolekül, das auch eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Zellmembran spielt. Überraschenderweise hemmt Ritanserin die Makropinozytose stark, indem es den Phospholipidstoffwechsel in TSC2-defizienten Zellen umprogrammiert. Daher könnte die Ausrichtung auf den Nährstoffaufnahmeweg der Makropinozytose in TSC2-defizienten Zellen neue therapeutische Ansätze bei TSC und LAM bieten.

Die Quantifizierung der makropinozytären Aufnahme in vitro und in vivo kann entscheidende Einblicke in die Regulation der Makropinosomenbildung liefern und die Entdeckung molekularer Mechanismen beschleunigen, während gleichzeitig neue therapeutische Ansätze identifiziert^{werden 2,6}. Bisher wurden mehrere Methoden entwickelt, die die makropinozytäre Aufnahme von Fluoreszenzdextran sowohl in vitro als auch in vivo angemessen quantifizieren ^2,15. Hier beschreiben wir einen durchflusszytometrischen Ansatz, um die Menge an internalisiertem Dextran und Albumin in mTORC1-hyperaktiven Zellen direkt zu bestimmen (Abbildung 1). Diese Methode kann verwendet werden, um mehrere experimentelle Bedingungen parallel zu analysieren und ergänzt bestehende bildbasierte Ansätze.

Abbildung 1. Arbeitsablauf zur Beurteilung der Makropinozytose in Säugetierzellen. Die Zellen werden in Sechs-Well-Platten ausgesät und anschließend mit interessanten Verbindungen behandelt. Fluoreszierendes Dextran oder BSA werden für 60 min zugegeben, und die Aufnahme wird durch das Waschen mit eiskaltem PBS gehemmt. Die Zellen werden mit Paraformaldehyd fixiert, und die Fluoreszenzintensität wird durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Die Zellen werden mit einem Gated versehen und die Daten mit der entsprechenden Software analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

1. Behandlung von Zellen

Tag 1

1. Züchten Sie TSC2-defiziente und TSC2-exprimierende embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus in dreifacher Ausfertigung in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Die Zellen sollten an Tag 3 zu 60-70% konfluent sein.
   1. Säen Sie zusätzliche Kontrollvertiefungen für jede Arzneimittelerkrankung, die nicht mit FITC-Dextran oder TMR-BSA gefärbt wird.

Tag 2

2. Saugen Sie das Medium vorsichtig an und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS bei Raumtemperatur.
   1. Behandeln Sie die Zellen mit Vehikel (DMSO), 100 μM Phosphatidsäure (PA), 25 μM EIPA, 10 μM Ritanserin oder einer Kombination aus PA und Ritanserin. Verwenden Sie DMEM, ergänzt mit 1% FBS.
      HINWEIS: Das DMSO-Volumen sollte dem maximalen Volumen des Lösungsmittels entsprechen, das bei der Behandlung von Bedingungen verwendet wird. Wenn beispielsweise 10 μl EIPA verwendet werden, sollte das Volumen von DMSO unter Fahrzeugbedingungen ebenfalls 10 μl betragen.

Tag 3

3. Ersetzen Sie das Medium durch serumfreies DMEM, das die oben genannten Arzneimittel und 0,5 mg/ml FITC-Dextran oder 0,5 mg/ml TMR-BSA 16 h nach der Behandlung enthält. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C/5% CO₂ -Zellkultur-Inkubator für 60 Minuten.
   HINWEIS: Um das Photobleichen der Fluorophore zu minimieren, sollten FITC-Dextran- und TMR-BSA-Röhrchen in Aluminiumfolie eingewickelt werden und das Experiment sollte in einem Zellkulturschrank bei ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden.
4. Medien ansaugen und zweimal mit eiskaltem PBS waschen.
   1. Trennen Sie die Zellen mit 500 μl Trypsin. Legen Sie die Zellen für 2-3 Minuten in einen 37 °C/5 % CO₂ -Zellkultur-Inkubator.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Zellen abgelöst sind, indem Sie sie unter einem Hellfeldmikroskop beobachten.
   2. Sammeln Sie die Zellen jedes Mal mit einer sauberen Pipettenspitze in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 % FBS-supplementiertem DMEM auf Eis.
   3. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 425 x g für 2 min bei 4 °C.
   4. Aspirieren Sie den Überstand.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 50 μl 2 % Paraformaldehyd.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist hochgiftig und sollte unter einem geeigneten Abzug gehandhabt werden. Formaldehydhaltige Abfälle sollten gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
   1. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   2. Geben Sie 1 ml eiskaltes PBS in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig. Lege die Röhren auf Eis.
6. Zellen bei 425 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren.
7. Aspirieren Sie den Überstand.
   1. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl eiskaltem PBS.
   2. Übertragen Sie die Zellen in die entsprechenden FACS-Röhrchen auf Eis.
   3. Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort.

2. Durchflusszytometrie

1. Wirbeln Sie die Zellen kurz ein, bevor Sie sie in den FACS-Probenhalter einsetzen.
2. Bei Verwendung einer Strömung mit niedriger Geschwindigkeit werden lebende Zellen von jeder ungefärbten Probe (Negativkontrolle) mit geeigneter Laserleistung geschnappt, wie in Abbildung 2A zu sehen ist. Dieser Schritt ist je nach Gerät unterschiedlich und muss für jedes Experiment optimiert werden. Passen Sie die Leistung sowohl für die Vorwärtsstreuung (FSC) als auch für die Seitenstreuung (SSC) so an, dass lebende Zellen von Ablagerungen oder Zellclustern unterschieden werden.
3. Wählen Sie mit der Autogate-Funktion die lebenden Zellpopulationen für jede Probe aus, um Zelltrümmer und Zellcluster zu vermeiden.
   HINWEIS: Alle Zellereignisse (unabhängig vom Gating) werden letztendlich vom Zytometer aufgezeichnet. Daher ist die Auswahl eines Tores in diesem Schritt nicht kritisch.
4. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Probe mit den entsprechenden grünen oder roten Lasern auf.

3. Durchflusszytometrische Analyse

1. Gate-Zellen mit Vorwärts- und Seitenstreuparametern. Wenden Sie denselben Gate auf alle Proben an.
2. Erstellen Sie Histogramme für die Fluoreszenz in jeder Probe wie in Abbildung 2B.
3. Berechnen Sie in jedem Cell Gate die mittlere/mittlere Fluoreszenzintensität für alle Proben.
4. Exportieren Sie Daten für eine geeignete statistische Analyse.
   HINWEIS: Während der Datenanalyse sollte die mittlere/mittlere Fluoreszenzintensität jeder Probe durch Subtraktion der ungefärbten Probenwerte normalisiert werden.

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Ergebnisse

Ritanserin hemmt die Makropinozytose in TSC2-defizienten Zellen
Wir haben bereits gezeigt, dass die makropinozytäre Aufnahme von Nährstoffen in TSC2-defizienten Zellen im Vergleich zu TSC2-exprimierenden Zellen um das Dreifache erhöht ist¹⁶. Bei TSC und LAM wird die Makropinozytose über die Diacylglycerinkinase alpha (DGKA) vermittelt. Das Stoffwechselprodukt von DGKA ist Phosphat...

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Diskussion

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Beurteilung der Makropinozytose mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht eine genaue und schnelle Messung des fluoreszenzmarkierten makropinozytären Frachtdextrans und Albumins. Frühere Studien haben den makropinozytären Index von Krebszellen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie sorgfältig charakterisiert^15,20. Obwohl diese Methoden die Internalisierung, Grö?...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-092	Growth media
EIPA (amiloride)	Sigma Aldrich	A3085	Macropinocytosis inhibitor
FBS	R&D Systems	S11150	Fetal Bovine Serum
FITC-Dextran	Invitrogen	D1822	Fluorescent polysaccharide (70kDa)
Parafolmadehyde	Pierce	28906	Fixation agent
PBS	Gibco	10010-023	Phosphate Buffer Saline
Penicilin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458-100ML	Cell culture antibiotics
Phosphatidic Acid	Avanti	840101P	Phospholipid derived from egg
Ritanserin	Tocris	1955	DGKA inhibitor
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	Fluorescent albumin
Trypsin	Sigma Aldrich	25300-054	Dissociation agent