Количественная оценка макропиноцитоза в гиперактивных клетках mTORC1 с помощью проточной цитометрии

Резюме

Этот протокол предоставляет экспериментальные инструменты для оценки поглощения макропиноцитарных питательных веществ (углеводов и белков) гиперактивными клетками mTORC1. Подробно описаны шаги по количественной оценке поглощения флуоресцентно меченного декстрана и бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Аннотация

Макропиноцитоз является высококонсервативным, актин-зависимым эндоцитарным процессом, который позволяет поглощать внеклеточный материал, включая белки и липиды. В пролиферирующих клетках макропиноцитоз может доставлять внеклеточные питательные вещества в лизосому, перерабатываемые в важнейшие строительные блоки макромолекул. Недавние исследования выявили зависимость множественных видов рака от макропиноцитоза, включая рак молочной железы, колоректальный рак и рак поджелудочной железы. Считается, что мутации Ras являются движущими событиями инициации макропиноцитоза, приводящими к активации клеточных анаболических процессов через сигнальный путь mTORC1. Интересно, что mTORC1 также может быть активирован путем макропиноцитоза независимо от Ras. Таким образом, макропиноцитоз представляет собой метаболическую уязвимость, которая может быть использована для нацеливания на макропиноцитарные опухоли путем ограничения их доступа к питательным веществам терапевтическим путем.

При комплексе туберозного склероза (ТСК) и лимфангиолейомиоматозе (ЛАМ) гиперактивация mTORC1 приводит к усилению макропиноцитоза и метаболическому перепрограммированию. В данной статье мы описываем основанный на проточной цитометрии протокол для количественной оценки макропиноцитоза в клетках млекопитающих. Используются TSC2-дефицитные MEF, которые демонстрируют аберрантную активацию mTORC1 и, как было показано, увеличивают макропиноцитоз по сравнению с клетками, экспрессирующими TSC2. Клетки, обработанные фармакологическими ингибиторами макропиноцитоза, инкубируют с флуоресцентно меченным, фиксируемым лизином, декстрана 70 кДа или флуоресцентно меченным бычьим сывороточным альбумином (БСА), анализируемым методом проточной цитометрии. На сегодняшний день разработаны надежные методы на основе изображений для количественной оценки макропиноцитоза в опухолевых клетках in vitro и in vivo. Этот анализ обеспечивает количественную оценку макропиноцитоза в различных экспериментальных условиях и дополняет существующие методы, основанные на изображениях.

Введение

Макропиноцитоз — это эндоцитарный процесс, направленный на массовое поглощение внеклеточного материала с последующим образованием макропиносом, либо перерабатываемых в плазматическую мембрану, либо сливающихся с лизосомами для разложения интернализованного груза ^1,2. Несмотря на то, что поглощение груза является неселективным, макропиноцитоз является многоступенчатым процессом, жестко регулируемым Rab ГТФазами и мембранными фосфолипидами ^3,4. Примечательно, что раковые клетки используют макропиноцитоз для усвоения внеклеточных питательных веществ, включая белки, полисахариды и липиды. Макропиноцитоз в раковых клетках активируется онкогенами, расположенными ниже по течению от Ras или v-Src, в качестве механизма поддержки их пролиферации, особенно в условиях нутриентного стресса ^5,6. Таким образом, макропиноцитоз представляет собой новый терапевтический подход к нацеливанию на раковые клетки путем нарушения путей поглощения питательных веществ ^7,8.

При комплексе туберозного склероза (ТСК) и лимфангиолейомиоматозе (ЛАМ) потеря функциональных мутаций в TSC1 или TSC2 приводит к гиперактивации млекопитающей/механистической мишени рапамицинового комплекса 1 (mTORC1)⁹. Известно, что аберрантная активация mTORC1 приводит к обширному метаболическому перепрограммированию, включая поглощение и утилизацию глюкозы и глутамина, усиленный синтез нуклеиновых кислот, синтез липидов и аутофагию^10,11. Чтобы компенсировать эти повышенные анаболические потребности, гиперактивные клетки mTORC1 увеличивают поглощение экзогенных питательных веществ посредством макропиноцитоза и усиливают лизосомальную деградацию интернализованного груза^. В недавней работе мы идентифицировали ритансерин, ингибитор диацилглицеролкиназы альфа (DGKA) как агент, который избирательно ингибирует пролиферацию клеток с дефицитом TSC2 ¹³. DGKA — это липидкиназа, которая метаболизирует диацилглицерин в фосфатидную кислоту (PA)¹⁴. ПА является важнейшей молекулой-посредником, которая также играет жизненно важную роль в поддержании гомеостаза клеточной мембраны. Удивительно, но ритансерин сильно ингибирует макропиноцитоз, перепрограммируя метаболизм фосфолипидов в клетках с дефицитом TSC2. Таким образом, нацеливание на путь поглощения питательных веществ макропиноцитозом в клетках с дефицитом TSC2 может обеспечить новые терапевтические подходы при ТСК и ЛАМ.

Количественная оценка поглощения макропиноцитов in vitro и in vivo может дать решающее представление о регуляции образования макропиносом и ускорить открытие молекулярных механизмов при одновременном выявлении новых терапевтических подходов ^2,6. На сегодняшний день разработано множество методологий, которые адекватно количественно оценивают макропиноцитарное поглощение флуоресцентного декстрана как in vitro, так и in vivo ^2,15. Здесь мы описываем подход, основанный на проточной цитометрии, для прямой оценки количества интернализованного декстрана и альбумина в гиперактивных клетках mTORC1 (рис. 1). Этот метод может быть использован для параллельного анализа нескольких экспериментальных условий и дополняет существующие подходы, основанные на изображениях.

Рисунок 1. Схема работы по оценке макропиноцитоза в клетках млекопитающих. Клетки засеивают в шестилуночные планшеты и затем обрабатывают представляющими интерес соединениями. Флуоресцентный декстран или БСА добавляются в течение 60 минут, а их поглощение подавляется промыванием ледяным PBS. Клетки фиксируют с помощью параформальдегида, а интенсивность флуоресценции количественно оценивают с помощью проточной цитометрии. Ячейки закрыты, а данные анализируются с помощью соответствующего программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

протокол

1. Клеточная обработка

День 1

1. Затравите TSC2-дефицитные и TSC2-экспрессирующие эмбриональные фибробласты (MEF) мышей в трех экземплярах, в каждой лунке шестилуночного планшета для культивирования тканей с использованием DMEM, с добавлением 10% FBS. К 3-му дню клетки должны быть слиты на 60-70%.
   1. Засейте дополнительные контрольные лунки для каждого состояния препарата, который не будет окрашен FITC-Dextan или TMR-BSA.

День 2

2. Тщательно отсадите среду и дважды промойте клетки PBS при комнатной температуре.
   1. Обрабатывайте клетки носителем (ДМСО), 100 мкМ фосфатидной кислоты (ПА), 25 мкМ ЭЙПА, 10 мкМ ритансерина или комбинацией ПА и ритансерина. Используйте DMEM с добавлением 1% FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем ДМСО должен быть равен максимальному объему растворителя, используемого в условиях обработки. Например, если используется 10 мкл EIPA, то объем ДМСО в условиях автомобиля также должен составлять 10 мкл.

День 3

3. Замените среды бессывороточными DMEM, содержащими вышеупомянутые препараты и 0,5 мг/мл FITC-Dextan или 0,5 мг/мл TMR-BSA через 16 ч после процедуры. Инкубируйте клетки в инкубаторе для клеточных культур с температурой 37 °C / 5%_CO2 в течение 60 минут.
   Примечание: Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание флуорофоров, пробирки FITC-Dextran и TMR-BSA следует обернуть алюминиевой фольгой, а эксперимент проводить в шкафу для клеточных культур с выключенным светом.
4. Асасируйте среду и дважды промывайтесь ледяным PBS.
   1. Отделите клетки с помощью 500 мкл трипсина. Поместите клетки в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 °C/5% CO₂ на 2-3 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все клетки отделены, наблюдая за ними под светлопольным микроскопом.
   2. Каждый раз используя чистый наконечник для пипетки, соберите клетки в пробирки объемом 1,5 мл с помощью 1% FBS DMEM на льду.
   3. Пеллетные ячейки путем центрифугирования при 425 x g в течение 2 мин при 4 °C.
   4. Аспирируйте надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте клеточную гранулу с использованием 50 мкл 2% параформальдегида.
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид очень токсичен и должен обрабатываться в соответствующем вытяжном шкафу. Отходы, содержащие формальдегид, следует утилизировать в соответствии с руководящими принципами учреждения.
   1. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 10 мин.
   2. Добавьте 1 мл ледяного PBS в каждую пробирку и осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу. Поместите трубки на лед.
6. Центрифугируйте ячейки при давлении 425 x g в течение 2 мин при 4 °C.
7. Аспирируйте надосадочную жидкость.
   1. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 300 мкл ледяного PBS.
   2. Перенесите ячейки в соответствующие трубки FACS на льду.
   3. Приступайте к проточной цитометрии.

2. Проточная цитометрия

1. Кратковременно сделайте вихревую обработку клеток перед тем, как вставить их в держатель образцов FACS.
2. Используя низкоскоростной поток, забирайте живые клетки из каждого неокрашенного образца (отрицательный контроль) с использованием соответствующей мощности лазера, как показано на рисунке 2A. Этот шаг отличается в зависимости от прибора и должен быть оптимизирован для каждого эксперимента. Отрегулируйте мощность как для прямого рассеяния (FSC), так и для бокового рассеяния (SSC) так, чтобы живые клетки отличались от мусора или кластеров клеток.
3. Используя функцию автогейта, выберите популяции живых клеток для каждого образца, избегая клеточного мусора и кластеров клеток.
   Примечание: Все клеточные события (независимо от стробирования) в конечном итоге регистрируются цитометром. Поэтому выбор строба на этом этапе не является критичным.
4. Запишите интенсивность флуоресценции каждого образца с помощью соответствующих зеленых или красных лазеров.

3. Анализ проточной цитометрии

1. Ячейки затвора с использованием параметров прямого и бокового рассеяния. Примените один и тот же затвор ко всем образцам.
2. Создайте гистограммы для флуоресценции в каждом образце, как показано на рисунке 2B.
3. В пределах каждого клеточного затвора рассчитайте среднюю/медианную интенсивность флуоресценции для всех образцов.
4. Экспортируйте данные для соответствующего статистического анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анализа данных средняя/медианная интенсивность флуоресценции каждого образца должна быть нормализована путем вычитания неокрашенных значений образца.

Результаты

Ритансерин ингибирует макропиноцитоз в клетках с дефицитом TSC2
Ранее мы показали, что макропиноцитарное поглощение питательных веществ увеличивается в три раза в клетках с дефицитом TSC2 по сравнению с клетками, экспрессирующими ...

Обсуждение

В данной статье мы описываем количественный подход к оценке макропиноцитоза с помощью проточной цитометрии. Этот метод обеспечивает точное и быстрое измерение флуоресцентно меченного макропиноцитарного грузового декстрана и альбумина. В предыдущих исследованиях ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-092	Growth media
EIPA (amiloride)	Sigma Aldrich	A3085	Macropinocytosis inhibitor
FBS	R&D Systems	S11150	Fetal Bovine Serum
FITC-Dextran	Invitrogen	D1822	Fluorescent polysaccharide (70kDa)
Parafolmadehyde	Pierce	28906	Fixation agent
PBS	Gibco	10010-023	Phosphate Buffer Saline
Penicilin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458-100ML	Cell culture antibiotics
Phosphatidic Acid	Avanti	840101P	Phospholipid derived from egg
Ritanserin	Tocris	1955	DGKA inhibitor
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	Fluorescent albumin
Trypsin	Sigma Aldrich	25300-054	Dissociation agent