CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

Zusammenfassung

Das CRISPR/Cas9-System hat es ermöglicht, genetisch veränderte Mäuse durch direkte Genom-Editierung mit befruchteten Zygoten zu entwickeln. Obwohl die Effizienz bei der Entwicklung von Gen-Knockout-Mäusen durch Induktion kleiner Indel-Mutationen ausreichend wäre, ist die Effizienz der embryonalen Genom-Editierung für die Herstellung von großformatigem DNA-Knock-In (KI) immer noch gering. Daher hat im Gegensatz zur direkten KI-Methode in Embryonen das Gen-Targeting mit embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) gefolgt von einer Embryoinjektion zur Entwicklung von Chimärenmäusen immer noch mehrere Vorteile (z. B. kann High-Throughput-Targeting in vitro, Multi-Allel-Manipulation und Cre - und Flox-Genmanipulation in kurzer Zeit durchgeführt werden). Darüber hinaus können auch Stämme mit schwer zu handhabenden Embryonen in vitro, wie BALB/c, für das ESC-Targeting verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt die optimierte Methode für großformatige DNA (mehrere kb) KI in ES-Zellen durch Anwendung von CRISPR / Cas9-vermittelter Genom-Editierung, gefolgt von der Produktion von Chimärenmäusen, um genmanipulierte Mausmodelle zu entwickeln.

Einleitung

Die Herstellung genetisch veränderter Mäuse und die Analyse ihres Phänotyps ermöglicht es uns, bestimmte Genfunktionen in vivo im Detail zu verstehen. Zahlreiche wichtige Erkenntnisse wurden an genmodifizierten Tiermodellen im Bereich Life Science gewonnen. Darüber hinaus hat sich seit dem Bericht über die Genom-Editing-Technologie mit CRISPR/Cas9¹ die Forschung mit genetisch veränderten Mäusen schnell auf viele Laboratorien ausgeweitet ^2,3. Die Genom-Editierung von Mauszygoten durch CRISPR/Cas9 hat eine akzeptable Effizienz für die Entwicklung kurzer DNA-Modifikationen erreicht, wie z.B. Indel-Mutation-orientierten Gen-Knockout⁴, Einzelnukleotidersatz oder kurze Peptid-Tag-Insertion unter Verwendung von einzelsträngigen Oligonukleotiden (ssODNs) als Knock-in-Donatoren (KI)⁵. Auf der anderen Seite bleibt die KI von großen DNA-Fragmenten in Zygoten durch Genome Editing im Vergleich zur kurzgroßen DNA-Modifikation ^6,7 bei einer geringen Effizienz. Darüber hinaus ist es schwierig, Mausstämme wie BALB/c, der für bestimmte Forschungsbereiche wie die Immunologie wichtig ist, für die zygotenbasierte Genom-Editierung zu verwenden, da ihre Präimplantationsembryonen anfällig für In-vitro-Manipulationen sind.

Eine weitere Möglichkeit, genetisch veränderte Mausmodelle zu entwickeln, besteht darin, die Targeting-Technik der embryonalen Stammzellen (ESC) zu verwenden, gefolgt von einer ESC-Injektion in den Präimplantationsembryo, um Chimären ^8,9,10 zu erzeugen^, die immer noch routinemäßig als konventionelle Methode verwendet wird. Obwohl die Erfassungsrate für die Gewinnung genauer KI-ESC-Klone bei herkömmlichen ESC-Targeting-Methoden nicht sehr hoch ist, bietet ESC-Targeting einige Vorteile gegenüber der Zygoten-Genom-Editierung, insbesondere für lange DNA-KI. Zum Beispiel ist die KI-Effizienz langer DNA-Fragmente (> mehrere kb) in das Zygotengenom weniger offensichtlich^6,7, und viele Zygoten werden benötigt, um auch nur eine Linie von KI-Mäusen zu entwickeln^, was in der aktuellen Perspektive von Tierversuchen unerwünscht ist. Im Gegensatz zur Zygoten-Genom-Editierung benötigt das Long-DNA-Targeting auf ES-Shirts, gefolgt von der Chimärenproduktion, deutlich weniger Embryonen als die Zygoten-Genom-Editierung. Obwohl die Präimplantationsembryonen von BALB/c anfällig für In-vitro-Manipulationen sind, können ihre ES-Zellen in vitro¹¹ als andere kompetente 129- oder F1-Hintergrund-ES-Zellen aufrechterhalten und behandelt werden, die daher für die Chimärenproduktion geeignet sind. Obwohl ein Targeting-Vektor 5' und 3' homologe Arme und Arzneimittelresistenz-Genkassetten für die positive oder negative Selektion enthält, ist die konventionelle KI-Effizienz von ES-Zellen aufgrund der hohen Häufigkeit der zufälligen genomischen Integration im Allgemeinen unzureichend ^8,10. Daher ist eine verbesserte Methode mit präziser ESC-Targeting-Effizienz erforderlich. Vor kurzem berichteten wir über eine optimierte ESC-KI-Methode mit CRISPR/Cas9-basierter Genom-Editierung, um eine höhere KI-Effizienz als herkömmliche Targeting-Methoden zu erreichen¹¹. Die hier beschriebene Methode basiert auf diesem Verfahren, das lange DNA (> mehreren bis 10 kb) KI zu ES-Zellen mit akzeptabler Effizienz für Routinearbeiten ohne Medikamentenauswahl ermöglicht; Somit wäre der Vektoraufbau viel einfacher und bräuchte einen kürzeren Zeitraum, oder auch die Zellkulturperiode würde deutlich kürzer.

Protokoll

Alle Mausversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Tokio (Zulassungsnummer PA17-63) und der Universität Osaka (Zulassungsnummer Biken-AP-H30-01) genehmigt und gemäß deren Richtlinien sowie den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) durchgeführt.

1. Targeting-Vektorkonstruktion

1. Amplifizieren Sie eine KI-Kassette (CreERT hier, Template-DNA für die PCR stammt ursprünglich von einem kommerziellen Gensyntheseunternehmen) und ein ca. 1 kb großes Fragment von 5'- oder 3'-Homologiearmen mittels PCR. Für die DNA-Klonierung (Schritt 1.3) fügen Sie 15-mer-Überlappungssequenzen am 5'-Ende jedes PCR-Primers hinzu. Die PCR-DNA-Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, gefolgt von der Extraktion des DNA-Fragments mit einem DNA-Reinigungskit.
2. Linearisieren Sie das Backbone-Plasmid (z. B. pUC19 oder pBS) mit einem geeigneten Restriktionsenzym, das irgendwo in der Multi-Klonierungsstelle für das Klonen eindeutig verdaut wird. Dann reinigen Sie das verdaute Plasmid mit einem DNA-Reinigungskit.
3. Klonen Sie jedes PCR-Fragment (z. B. 5'-Homologiearm, 3'-Homologiearm) und KI-Sequenz gleichzeitig in das verdaute Plasmid mit einem DNA-Klonierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Die kompetenten Zellen werden mit dem konstruierten Plasmid (Schritt 1.3) transformiert, indem sie 1 min lang in einem Wasserbad bei 42 °C erhitzt und dann auf einer LB-Platte mit der entsprechenden Konzentration an Antibiotika wie Ampicillin oder Kanamycin ausgesät werden. Kultivieren Sie sie über Nacht für resistente Klonelektionen.
5. Nehmen Sie mehrere (vier bis acht) einzelne Kolonien mit 200 μL Pipettenspitzen auf und geben Sie die Spitzen in 3 ml flüssiges LB mit geeigneten Antibiotika (100 μg/ml Ampicillin oder 20 μL/ml Kanamycin) und kultivieren Sie sie über Nacht bei 37 °C unter Schütteln.
6. Reinigen Sie das Plasmid am nächsten Tag mit einem endotoxinfreien kommerziellen Plasmidreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestätigen Sie die klonierte Sequenz im Plasmid durch Sanger-Sequenzierung. Stellen Sie die Plasmidkonzentration bei 1 μg DNA/μL mit nukleasefreiem Wasser ein. Verwenden Sie das Plasmid als Gen-Targeting-Vektor.

2. Vorbereitung des embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF) als Feederzellen für ESC

1. Opfern Sie 8-10 Wochen alte trächtige weibliche ICR-Mäuse (14,5 Tage nach dem Koitum) durch zervikale Dislokation. Wischen Sie den Bauch gut ab, indem Sie 70% (v / v) Ethanol für die Sterilisation verwenden, schneiden Sie den Bauch mit einer Orbitalschere und einer Pinzette ab und stellen Sie die fötushaltige Gebärmutter wieder her.
2. Geben Sie die Gebärmutter in eine 100-mm-Schale, die 10 ml Phosphat-Rinderserum (PBS) enthält, das 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin enthält. Entfernen Sie die Plazenten und extraembryonalen Gewebe von den Föten mit einer Orbitalschere und einer Pinzette. Zerkleinern Sie die Föten mit einer Orbitalschere und übertragen Sie die PBS-Lösung, die die gehackten fötalen Zellen enthält, in ein 50 ml konisches Röhrchen.
3. Bei 280 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand durch Absaugen verwerfen. Fügen Sie 10 ml 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, mischen Sie gut durch Pipettieren und inkubieren Sie dann 10 min bei 37 °C mit einem Wasserbad für den Trypsinaufschluss.
4. Fügen Sie 20 ml MEF-Medium hinzu (DMEM mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin), um die enzymatische Reaktion zu stoppen, mischen Sie gut durch sanfte Inversion und zentrifugieren Sie bei 280 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand durch Aspiration, fügen Sie 10 ml MEF-Medium hinzu und mischen Sie gut durch Pipettieren.
5. Säen Sie die Zellsuspension in mehrere neue 100-mm-Schalen (bereiten Sie die gleiche Anzahl von Schalen wie die Anzahl der Föten mit 10 ml MEF-Medium für eine 100-mm-Schale vor). Ändern Sie das Medium 4 bis 5 Stunden nach der Aussaat, um nicht befestigte Zellen zu entfernen und das angehängte MEF wachsen zu lassen. Durchqueren Sie die Zellen, wenn sie ~ 80% Konfluenz mit Trypsin erreichen.
6. Legen Sie die Kulturschalen mit dem proliferierenden MEF in MEF-Medium, etwa 12-15 Tage nach der Aussaat, in ein Röntgenbestrahlungsgerät. Belichten Sie das MEF mit einer 50 Gy Röntgenaufnahme (insgesamt), um den Zellzyklus gemäß den Anweisungen des Herstellers anzuhalten.
7. Trypsinisieren Sie das bestrahlte MEF durch Zugabe von 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA für eine 100-mm-Schale für 5 min bei 37 °C, fügen Sie dann 4 ml MEF-Medium hinzu, um die Trypsinverdauung zu stoppen, und sammeln Sie die Zellsuspension in einem neuen 50-ml-Röhrchen.
8. Waschen Sie das MEF mit einem frischen MEF-Medium durch Zentrifugieren bei 280 x g für 5 min bei 4 °C, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung und frieren Sie sie bei 1,6 x 10⁶ Zellen/Röhrchen in einem Zellgefriermedium ein. Bis zur Verwendung aufbewahren; Zellen können über mehrere Jahre stabil in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

3. Cas9-RNP-DNA-Mischungspräparat

1. tracrRNA und crisprRNA werden durch Pipettieren in Verdünnungspuffer (jede RNA-Konzentration bei 200 μM) gelöst. Mischen Sie die tracrRNA-Lösung, die crisprRNA-Lösung und den Verdünnungspuffer (Volumenverhältnis bei 2:2:5) durch vorsichtiges Klopfen und Glühen jeder RNA mit einem Thermocycler bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 1 °C/min Stepdown-Zyklen, bis die Temperatur 4 °C erreicht.
   HINWEIS: Die gRNA-Sequenz wurde mit CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
2. Die geglühten RNAs, die 10 μg/μL Cas9-Nuklease und der Elektroporationspuffer werden in einem Volumenverhältnis von 5:3:2 bei 37 °C für 20 min inkubiert, um den Cas9-RNP-Komplex zu bilden. In der Routinearbeit mischen und inkubieren Sie 1,25 μL geglühte RNA, 0,75 μL Cas9-Nuklease und 0,5 μL des Elektroporationspuffers für die Genombearbeitung eines Locus.
3. Mischen Sie die folgenden Materialien in einem 1,5-ml-Röhrchen: 10 μL Elektroporationspuffer, 1 μL Cas9-RNP-Komplex (Schritt 3.2) und 1 μL kreisförmiger Zielvektor (1 μg/μL, Schritt 1.6). Die Gesamtmenge der Cas9-RNP-DNA-Mischung beträgt 12 μL. Bewahren Sie die Cas9-RNP-DNA-Mischung bis zur Elektroporation auf Eis auf.
   HINWEIS: Um eine erneute Spaltung der gRNA nach KI zu verhindern, entwerfen Sie die gRNA an einer Position, an der die gRNA-Erkennungssequenz durch die Integration des KI-Donors aufgeteilt wird. Wenn die gRNA an einem solchen Ort nicht entworfen werden kann, werden mehrere nukleotidstille Mutationen, durch die sich die Aminosäuresequenz nicht verändert, in das Plasmid des KI-Donors aufgenommen.

4. Gen-Targeting von ES-Zellen

1. Um die mit Gelatine überzogenen Zellkulturschalen vorzubereiten, fügen Sie 0,1% (w/v) Gelatinelösung bei 2 ml für eine 60-mm-Schale, 500 μL für eine 24-Well-Platte, 100 μL für eine 96-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie für 2 h in einem feuchten Inkubator. Entfernen Sie die Gelatinelösung, waschen Sie zweimal mit der gleichen Menge PBS und lagern Sie sie bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur.
2. Mit einem 37 °C-Wasserbad 1 min mitotisch inaktivierte gefrorene MEF-Brühe (Schritt 2.2) auftauen und 1 Tag vor der ESC-Aussaat auf eine mit Gelatine beschichtete 60-mm-Schale legen (ein gefrorenes Brührohr MEF mit 1,6 x 10⁶ Zellen für zwei 60-mm-Schalen, Schritt 2.2).
3. Ein gefrorenes ESC-Vorratsröhrchen (gelagert bei 2 x 10 5 ESCs/Röhrchen; die Zellzählung wurde mit einem Zellzähler durchgeführt) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 min auftauen und 1 x 10⁵ ESCs auf eine 60 mm Schale mit vorgesätem MEF geben (Schritt 4.1).
4. Kultur in 4 mL ESC-Kulturmedium (ESCM, DMEM-basiertes modifiziertes Medium mit 15% (v/v) fetalem Rinderserum, 2 mM L-Glutaminsubstrat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, Leukämie-Hemmfaktor und t2i (0,2 μM PD0325901 und 3 μM CHIR99021), das die Pluripotenz von ESC¹¹) bei 37 °C mit 5%_CO2 aufrechterhält, bis der ESC 50% bis 70% Konfluenz erreicht.
   HINWEIS: Wir verwenden drei verschiedene Linien von ESC: JM8. A3 aus B6N, V6.5 aus B6-129 F1 und Eigenentwicklung BALB/c ESC. Die gleichen KI-Protokolle in diesem Manuskript werden für alle ESC-Linien verwendet.
5. Die Kultivierungs-ESC mit 4 ml PBS waschen und dann mit 800 μL 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung 5 min bei 37 °C zur Verdauung behandeln. Fügen Sie 1 ml ESCM hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und dissoziieren Sie die ES-Zellen durch Pipettieren in einzelne Zellen.
6. Zentrifugieren Sie die ESC-haltige Lösung für 5 min bei 280 x g, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ES-Zellen in frischem 1 ml ESCM und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung. 1 x 10 5 ESCs in ein neues^1,5 ml Röhrchen geben und dreimal mit PBS durch Zentrifugieren bei 500 x g, 4 °C waschen.
7. Resuspendieren Sie das ESC-Pellet in 12 μL Cas9-RNP-DNA-Mischung (Schritt 3.3) und mischen Sie es gut durch vorsichtiges Pipettieren, um ein Sprudeln zu vermeiden. Dienen Sie dem resuspendierten ESC für die Elektroporation. Das Elektroporationssystem verwendet einen einzelnen Puls bei 1.400 V und 30 ms für die Cas9-RNP-DNA-Transduktion (Abbildung 1).
8. Kultur der elektropolierten ESCs in einer 60-mm-Schale mit 4 ml ESCM mit mitotisch inaktiviertem MEF (Abschnitt 4.2). Wechseln Sie das Medium jeden Tag.
9. Die ESCs 3 bis 5 Tage nach der Elektroporation mit 4 ml PBS waschen, dann mit 800 μL 0,25% Trypsin-EDTA behandeln und bei 37 °C für 5 min in einem feuchten Inkubator zur Verdauung kultivieren. Fügen Sie 2 ml ESCM hinzu, um den Trypsinverdau zu stoppen, und zentrifugieren Sie die Zellmischung bei 280 x g für 5 min.
10. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die ES-Zellen in 1 ml frischem ESCM und zählen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung. Durchlassung der ESCs bei 1 x 10³ ESCs pro 60 mm Schüssel mit ESCM und Feeder MEF. Wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die Kolonie aufnimmt.
    HINWEIS: Der Grund, warum die ESC einmal vor der Aufnahme bestanden wird, war, dass die Genom-Editierung nach der ESC-Teilung weiterhin stattfinden kann, so dass die erste Kolonie in vielen Fällen nicht immer der Klon ist. Daher ist die erste Passage von ESC vor der Aufnahme der Kolonie ein wesentlicher Schritt, um einzelne Klone aufzunehmen.

5. PCR-Genotypisierung von Ziel-ES-Zellen

1. ESCM 5 bis 7 Tage nach der ersten Passage (Schritt 4.9) aus der ESC-Kulturschale absaugen und 4 ml PBS hinzufügen. Nehmen Sie einzelne ESC-Kolonien mit 5 μL PBS mit einer 20-μL-Pipette unter einem Stereomikroskop (30-fache bis 40-fache Vergrößerung) auf. Legen Sie die einzelnen Kolonien in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden, die 15 μL 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung enthält.
2. Halten Sie die 96-Well-Platte auf Eis, bis 48 einzelne Kolonien aufgenommen wurden. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte für 5 min in einem 37 °C feuchten 5%_{CO2-Inkubator} , fügen Sie dann 80 μL ESCM hinzu, um den Trypsinverdau zu stoppen und ESC-Kolonien durch Pipettieren in einzelne Zellen zu dissoziieren.
   HINWEIS: Da die KI-Effizienz dieser Methode normalerweise 10%-50% beträgt, nehmen wir routinemäßig 48 Klone auf und führen zunächst eine Genotypisierung mit 24 von ihnen durch. Wenn zu diesem Zeitpunkt nicht mehrere KI-Klone erhalten werden können, suchen wir mit den verbleibenden 24 Klonen weiter nach KI.
3. 40 μL ESC-Suspension (Schritt 5) werden zur PCR-Genotypisierung in eine mit Gelatine beschichtete, dosiererfreie 96-Well-Platte mit 50 μL ESCM pro Vertiefung überführt. Die restlichen 60 μL ESC-Suspension werden in eine Vertiefung in einer mit Gelatine beschichteten 24-Well-Platte überführt, die 500 μL ESCM und MEF enthält, um den gefrorenen ESC-Bestand herzustellen.
4. Lagern Sie einzelne ESC-Klone, die in der 24-Well-Platte kultiviert werden (Schritt 5.3), bis sie eine Konfluenz von 60% bis 80% erreichen. Gewinnen Sie einzelne ESC-Klone durch Trypsinisierung, wie oben erwähnt, sammeln Sie Zellen in einem neuen 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 280 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL Zellgefriermedium und frieren Sie sie mit einer -80 °C Tiefkühltruhe ein.
5. Für die PCR-Genotypisierung werden Kultur-ESC-Klone in der 96-Well-Feeder-freien Platte (Schritt 5.3) durchgeführt, bis die ESC eine Konfluenz von mehr als 90% erreicht. Entfernen Sie ESCM aus jeder Vertiefung durch Absaugen und waschen Sie zweimal mit 100 μL PBS.
6. Das PBS absaugen und 100 μL Lysepuffer hinzufügen, der Proteinase K enthält, gut mischen und das ESC-Lysat in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen. Das ESC-Lysat wird in einer Wärmekammer mindestens 1 h lang bei 65 °C erhitzt. Extrahieren und reinigen Sie die genomische DNA mit einer herkömmlichen Phenol-Chloroform-DNA-Reinigungsmethode, gefolgt von Ethanolfällung.
7. Die gefällte DNA wird in 20 μL DNasefreiem Wasser gelöst und die Reinheit und Konzentration der DNA mit einem Spektralphotometer bestimmt. Führen Sie genomische PCR mit locusspezifischen Primer-Sets durch, um die Zielregion zu amplifizieren. Überprüfen Sie dann die Sequenz und wählen Sie die ESC-Klone mit den gewünschten KI-Sequenzen aus.

6. Vorbereitung eines Embryos im Achtzellstadium und Mikroinjektion von ES-Zellen

1. Injizieren Sie 5 IE Serumgonadotropin (PMSG) intraperitoneal in erwachsene ICR-Weibchen. Nach 48 Stunden injizieren Sie 5 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) in dieselben Weibchen und paaren Sie dann die hormonbehandelten Weibchen mit den ICR-Männern. Überprüfen Sie den Kopulationspfropfen in der Vagina am nächsten Tag (embryonaler Tag 0,5, ED0,5).
   HINWEIS: Um Chimärismus nach Fellfarbverhältnissen zu bewerten, verwenden Sie Blastozyste aus dem ICR-Stamm als Empfänger für einen ESC mit schwarzem oder agouti-Fellfarbhintergrund oder Blastozyste aus dem C57BL / 6-Stamm als Empfänger für einen ESC mit Albino-Hintergrund.
2. Sammeln Sie den Eileiter bei ED1,5 und legen Sie ihn in HEPES-Puffermedium (FHM) Tropfen. Gewinnen Sie die zweizelligen oder vierzelligen Embryonen zurück, indem Sie den Eileiter mit FHM spülen, indem Sie eine in das Infundibulum eingeführte Spülnadel verwenden.
3. Waschen Sie die gesammelten Embryonen, indem Sie sie mit einer Mundpipette in mehrere frische FHM-Tropfen geben. Kultur Die Embryonen in 50 μL KSOM tropfen auf eine 35 mm Zellkulturschale, die mit Mineralöl bedeckt ist, bei 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 1 Tag, bis das Achtzell- oder Morulastadium (_ED2,5 ) erreicht ist.
4. Wenn die Embryonen am nächsten Entnahmetag nicht verwendet werden, frieren Sie sie durch Vitrifikation gemäß dem CARD-Protokoll (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff.
5. Glaspipetten für die Aufnahme der Embryonen (80-100 μm Außendurchmesser) und ESC-Injektion (ca. 13 μm Durchmesser) mit einem Abzieher und einer Mikroschmiede vorbereiten.
6. Integrieren Sie eine Haltepipette, die FHM enthält, in einen Kapillarhalter, der mit einem Mikroinjektor verbunden ist und auf der linken Seite des Mikromanipulators aufgestellt ist. Schließen Sie eine Injektionspipette an einen anderen Mikroinjektor an und stellen Sie sie auf der rechten Seite auf. Richten Sie die beiden Pipetten gerade im Feld der Mikroskopansicht aus.
7. Geben Sie 5 μL Tropfen 12% (w/v) Polyvinylpyrrolidon (PVP) in FHM-Medium und 5 μL Tropfen FHM nebeneinander auf den gleichen Deckel einer 60 mm Schale und bedecken Sie die Tropfen mit Mineralöl. Transferembryonen im 5 μL FHM-Tropfen und Zugabe von 1-5 μL der ESC-Suspension zum FHM-Tropfen, der Embryonen enthält.
   HINWEIS: Lassen Sie die ESC- und MEF-Suspension vor der Tropfenvorbereitung für 30 min in der 4 ml ESM auf 60mm Kulturschale. Da MEFs schneller am Boden haften als ES-Zellen, ermöglicht diese 30-minütige Inkubation die Konzentration von nicht anhaftenden ES-Zellen im Überstand.
8. In der Injektionspipette mit PVP waschen und dann zu dem Tropfen wechseln, der die Embryonen und ES-Zellen enthält.
9. Nehmen Sie drei einzelne ECS-Dubletten auf, die gerade ihre Zellteilung (sechs Zellen) in der Injektionspipette beendet haben. Halten Sie einen Embryo im Achtzell- oder Morulastadium, der die Verdichtung abgeschlossen hat, mit der Haltepipette durch Aspiration. Machen Sie ein Loch in die Zona pellucida mit einem piezoelektrischen Impuls (Intensität: 3; Geschwindigkeit: 3). Vertreiben Sie die sechszellige ESC in der Zona pellucida und ziehen Sie die Pipette aus den Embryonen.
10. Die ESC-injizierten Embryonen mit mehreren KSOM-Tropfen vorsichtig mit einer Mundpipette waschen und in einem neuen 50 μL KSOM-Tropfen mit Mineralöl bedeckt bei 37 °C, 5%_CO2 inkubieren, bis sich die Embryonen zum Blastozystenstadium entwickeln.
11. Übertragen Sie die 10 ESC-injizierten Blastozysten in jedes Uterushorn pseudoschwangerer weiblicher Mäuse (2,5 Tage nach dem Koitum, 20 Blastozysten pro Kopf).
12. Nachdem die Leihmutter geboren hat, wählen Sie mindestens zwei männliche Chimären mit dem höchsten Chimärismusverhältnis (70% oder höher, wie durch die Fellfarbe bestätigt) und paaren Sie sie dann mit geeigneten Stammweibchen, um F1 heterozygote KI zu erhalten.
13. Züchten Sie einzelne KI-Mäuse mit geeigneten Partnern, um Mäuse mit wünschenswerten Genotypen oder genetischen Hintergründen zu erhalten, die für die Forschung geeignet sind.

Ergebnisse

Wir haben spezifische Gene im ESC ins Visier genommen, gefolgt von der Chimärenproduktion, um eine genmanipulierte Mausproduktion gemäß unserem vorherigen Manuskript¹¹ zu entwickeln. Die ESC-Genotypisierung (beschrieben in Abschnitt 4) wird routinemäßig mittels PCR unter Verwendung von Primern durchgeführt. Die Primer sind auf genomischen Sequenzen außerhalb der Homologiearme und den spezifischen Sequenzen im KI-DNA-Fragment ausgelegt (Abbildung 2A). In diesem Fall wird kein Wildtyp-Allel amplifiziert, während ein PCR-Amplikon einer bestimmten Größe nur nachgewiesen wird, wenn die gezielte exogene DNA KI am Zielort ist. Repräsentative Genotypisierungs-PCR-Ergebnisse sind in Abbildung 2B dargestellt. Neun von 22 Klonen (40,9%) zeigten in diesem Fall eine KI-spezifische Bande. Drei repräsentative Targeting-Ergebnisse, einschließlich des in Abbildung 2 dargestellten Ergebnisses, sind in Tabelle 1 dargestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die hier gezeigte Methode für Gen-KI ohne Medikamentenauswahl effizient und reproduzierbar ist.

ESC wird in einer Injektionspipette aufgenommen, dann wird ein Loch in der Zona pellucida mit einem piezoelektrischen Plus gemacht und das ESC wird zwischen den embryonalen Zellen freigesetzt (Abbildung 3). Technisch gesehen ähnelt dieses Protokoll zur Injektion eines ESC in einen Embryo im Achtzell- oder Morulastadium dem Protokoll für die ESC-Injektion in eine Blastozyste, das üblicherweise in vielen Mauseinrichtungen verwendet wird. Repräsentative chimäre Mäuse sind in Abbildung 4 dargestellt. Für die Fellfarbbewertung des Chimärismus wurde der Embryo aus dem ICR-Stamm (Albino, weißes Haar) als Empfänger von B6 oder B6-129 F1 ESC und B6-Embryonen als Empfänger von BALB/c-ES-Zellen verwendet (Abbildung 4).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der CRISPR/Cas9-Ribonukleoprotein (RNP)-vermittelten zirkulären Plasmidintegration in den spezifischen Ort eines ESC-Genoms. Die Elektroporation führt ein zirkuläres Plasmid als Zielvektor in ESCs mit Cas9-RNP ein. Abkürzungen: GOI = Gen of Interest, HA = Homologiearm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Genomische PCR-Analysen für das KI-Screening von gezielten ESC-Klonen . (A) KI-spezifische PCR-Primer werden auf genomischen Sequenzen außerhalb der Homologiearme (vorwärts) und in den spezifischen Sequenzen im KI-DNA-Fragment (umgekehrt) entwickelt. (B) Repräsentative Genotypisierungs-PCR-Ergebnisse. Ein Wildtyp-Genom wurde als Negativkontrolle verwendet. Abkürzungen: GOI = Gen of Interest, HA = Homologiearm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Injektion von Embryonen im Achtzellstadium . (A) Für die Mikroinjektion werden drei Dubletten von ES-Zellen (sechs Zellen, Pfeilspitzen) aufgenommen. (B) Ein Loch in der Zona pellucida wird mit einem piezoelektrischen Impuls gemacht, und ESCs werden zwischen jedem Blastomer ausgestoßen. Der dargestellte Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Repräsentative Bilder von Chimärenmäusen . (A,B) Der ESC abgeleitet von C57BL/6N (JM8. A3, Agouti Haar; A) oder B6-129 F1 (Agouti Haar; B) werden in ICR-Embryonen (Albino, weißes Haar) injiziert, gefolgt von der Übertragung der Embryonen auf die Mutterleihmuttern. (C) Das aus BALB/c (Albino, weißes Haar) gewonnene ESC wird in C57BL/6J (schwarzes Haar) Embryonen injiziert, gefolgt von der Übertragung der Embryonen auf Mutterleihmütter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Projekt-ID	Choromosom	5'HA Länge (bp)	3'HA Länge (bp)	Einlegegröße (bp)	Anzahl der analysierten Klone	Anzahl der KI-Klone	Wirkungsgrad (%)	Bemerkungen
R26-CC*	Chr6	965	1006	5321	23	2	8.7%	-
R4-03*	Chr8	1000	997	3070	22	6	27.3%	-
P4-01*	Chr15	1000	1000	2569	22	9	40.9%	Abbildung 2

Tabelle 1: KI-Wirkungsgrade in drei unabhängigen genomischen Loci im ESC. *Diese Projekte wurden bisher nicht veröffentlicht. Der Name dieser Gene wird in Zukunft in unabhängigen Manuskripten bekannt gegeben.

Diskussion

Das Gen-Targeting von ES-Zellen, gefolgt von der Chimärenproduktion, wurde konventionell für die Entwicklung genmanipulierter Mäuse verwendet. Dennoch bleibt die Gen-Knock-in-Effizienz gering, obwohl der Targeting-Vektor lange (> mehrere kb in der Regel) Homologiearme mit positiven oder negativen Medikamentenauswahl-Genkassetten enthält. Unser Protokoll führte eine abgestimmte ESC-KI-Methode mit langer exogener DNA unter Verwendung eines zirkulären Plasmids ohne Medikamentenauswahlkassetten als Zielvektor ein, begleitet von Cas9-RNP-vermittelter Genombearbeitung mit einer akzeptablen Effizienz für Routinearbeiten. Somit könnte dieses Protokoll dazu beitragen, die Zeit für die Herstellung genetisch veränderter chimärer Mäuse im Vergleich zum herkömmlichen ESC-Targeting erheblich zu reduzieren.

In diesem Protokoll verwendeten wir CRISPR / Cas9-RNP, um ortsspezifische Doppelstrangbrüche im Genom zu induzieren, und ein zirkuläres Plasmid wurde anstelle eines linearisierten Vektors als Zielvektor verwendet. Linearisierte Plasmide werden aufgrund ihrer erhöhten Effizienz der genomischen Integration herkömmlicherweise als Zielvektor für Gen-KI verwendet ^8,9,10. Viele genomische Integrationen sind jedoch unspezifisch, obwohl der Vektor homologe Arme^{enthält 9}. Auf der anderen Seite werden zirkuläre Plasmide selten als Zielvektoren verwendet, da sie schwer in das Genom von ES-Zellen¹² oder Fibroblasten¹³ zu integrieren sind. Daher wäre es möglich, dass die Anwendung eines zirkulären Plasmids als Zielvektor begleitet von CRISPR / Cas9-vermittelter Genom-Editierung die unspezifische Zufallsintegration minimiert, aber die ortsspezifische Integration in das ESC-Genom maximiert. Es wäre bemerkenswert, dass die Induktionseffizienz des Doppelstrangbruchs durch CRISPR/Cas9 ziemlich wichtig ist¹⁴, daher wäre es wichtig, gRNA zu verwenden, die einen Doppelstrangbruch bei hoher Effizienz induziert. Es sollte erwogen werden, gRNA neu zu gestalten, wenn die KI-Effizienz zu niedrig ist. In dem in Abbildung 2 gezeigten Fall zeigten 40,9% der ESC-Klone eine KI-spezifische Bande. Tatsächlich führen wir als Kernlabor des Instituts routinemäßig Gen-Targeting mit ES-Zellen nach der hier beschriebenen Methode durch und haben KI-Wirkungsgrade von 10%-50% für 1-2 kb-Sequenzen wie Cre, CreERT oder fluoreszierende Reporter erreicht, obwohl es je nach Genlocus einige Variationen gibt. Die längsten DNA-Sequenzen, die wir mit dieser Methode erfolgreich KI haben, sind etwa 11,2 kb in den Rosa26-Locus, und die Effizienz betrug 12,2% (fünf KI-Kolonien von 41 analysierten Kolonien).

Es ist auch bemerkenswert, dass dieses Protokoll Embryonen im Achtzell- oder Morulastadium als Empfänger für die ESC-Mikroinjektion verwendet, jedoch keine Embryonen im Blastozystenstadium. Obwohl wir in diesem Artikel keine Vergleichsexperimente durchgeführt haben, haben mehrere Berichte gezeigt, dass die Injektion von ES-Zellen in Embryonen im Achtzell- oder Morulastadium die Effizienz des ESC-Beitrags zu chimären Nachkommen im Vergleich zur ESC-Injektion in Blastozysten signifikant verbessert^15,16,17,18 . Tatsächlich führten ESC-Injektionen verschiedener ESC-Linien, einschließlich C57BL / 6, B6-129 F1 und BALB / c, häufig bei einigen, aber nicht allen Nachkommen zu Chimären mit hoher Schichtfarbe (siehe Abbildung 4). Die Einschränkung der Methode besteht darin, dass die in den Präimplantationsembryo injizierten ES-Zellen nicht immer zu Keimzellen in einer Chimäre^{beitragen konnten 19,20}. Die Keimbahnübertragung von ES-Zellen würde von der Qualität jedes ESC-Klons abhängen¹⁹. Daher wäre es vorteilhaft, mehrere ESC-Klonlinien als Backup für eine stabile chimäre Mausproduktion zu entwickeln. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellten Protokolle einfache Targeting-Vektoren verwenden, die nur jeden Homologiearm und jedes Gen von Interesse für KI ohne arzneimittelresistente Kassette enthalten. Daher wäre die Vektorkonstruktion viel einfacher und die Kulturperiode könnte im Vergleich zur herkömmlichen ESC-Targeting-Technik verkürzt werden. Dies würde helfen, schnell und einfach verschiedene Arten von genetisch veränderten Mäusen für zukünftige Analysen in den Biowissenschaften zu produzieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c ESC	-	-	ESC developed from BALB/c strain
Bambanker	Nippon Genetics	CS-02-001	Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere
Cas9 Nuclease V3	IDT	1081059	Section 3.2 and elsewhere.
CHIR99021	FUJIFILM Wako	038-23101	Section 4.3
CreERT gene fragment	GeneWiz		Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA	IDT		crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.
CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072534	tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.
DMEM	Nacalai	08458-45	MEF medium. Section 2.3 and elsewhere
Duplex buffer	IDT	1072534	RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.
FastGene Gel/PCR Extraction Kit	Nippon Genetics	FG-91302	Section 1.1 and 1.2.
GlutaMax	Thermo Fisher	35-050-061	L-glutatime substrate
hCG	ASKA Animal Health		Section 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit	Clontech	639648	DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere
JM8.A3 ESC	EuMMCR	-	ESC developed from C57BL/6N strain
Knock-out DMEM	Thermo Fisher	10829018	Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.
KSOM	Merck	MR-121-D	Section 6.3 and 6.9.
Leukemia inhibitory factor	FUJIFILM Wako	125-05603	Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.
Neon Electroporation system	Thermo Fisher	MPK5000	Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade	Takara	U0490B	Section 1.6.
PD0325901	FUJIFILM Wako	162-25291	Section 4.3
PMSG	ASKA Animal Health		Section 6.1.
Tail lysis buffer	Nacalai	06169-95	Section 5.5.
Trypsin-EDTA	Nacalai	32777-15	Section 2.2 and elsewhere
V6.5 ESC	-	-	ESC developed from B6J-129 F1 strain
X-ray irradiation device	Hitachi	MBR-1618R-BE	Section 2.6.