Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Resumo

O sistema CRISPR/Cas9 tornou possível o desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados por edição direta do genoma usando zigotos fertilizados. No entanto, embora a eficiência no desenvolvimento de camundongos nocauteadores de genes, induzindo pequenas mutações indel, seja suficiente, a eficiência da edição do genoma embrionário para fazer knock-in de DNA de grande porte (KI) ainda é baixa. Portanto, em contraste com o método KI direto em embriões, o direcionamento de genes usando células-tronco embrionárias (ESCs) seguidas de injeção de embriões para desenvolver camundongos quimera ainda tem várias vantagens (por exemplo, direcionamento de alto rendimento in vitro, manipulação multi-alelo e manipulação de genes Cre e flox pode ser realizada em um curto período). Além disso, cepas com embriões in vitro de difícil manuseio, como BALB/c, também podem ser usadas para segmentação ESC. Este protocolo descreve o método otimizado para KI de DNA de grande porte (vários kb) em ESCs aplicando edição de genoma mediada por CRISPR/Cas9 seguida pela produção de camundongos quimera para desenvolver modelos de camundongos manipulados por genes.

Introdução

Produzir camundongos geneticamente modificados e analisar seu fenótipo nos permite entender as funções genéticas específicas em detalhes, in vivo. Numerosas descobertas importantes foram descobertas usando modelos animais modificados por genes no campo das ciências da vida. Além disso, desde o relato da tecnologia de edição de genoma utilizando CRISPR/Cas9¹, pesquisas com camundongos geneticamente modificados rapidamente se espalharam para muitos laboratórios ^2,3. A edição do genoma de zigotos de camundongos por CRISPR/Cas9 alcançou eficiência aceitável para o desenvolvimento de modificações curtas de DNA, como knockout⁴ do gene orientado à mutação indel, substituição de nucleotídeo único ou inserção curta de peptídeo tag usando oligonucleotídeos de fita simples (ssODNs) como doadores knock-in (KI)⁵. Por outro lado, o KI de grandes fragmentos de DNA em zigotos por edição de genoma permanece em baixa eficiência em comparação com a modificação de DNA de tamanho curto ^6,7. Além disso, é difícil usar cepas de camundongos como BALB/c, que é uma cepa importante para áreas de pesquisa específicas como imunologia, para edição de genoma baseada em zigoto porque seus embriões pré-implantação são suscetíveis à manipulação in vitro.

Outra forma de desenvolver modelos de camundongos geneticamente modificados é utilizar a técnica de focalização de células-tronco embrionárias (ESC) seguida de injeção de ESC no embrião pré-implantacional para produzir quimeras ^8,9,10, que ainda é rotineiramente utilizada como método convencional. Embora a taxa de aquisição para a obtenção de clones precisos de KI-ESC não seja muito alta nos métodos convencionais de segmentação ESC, a segmentação ESC oferece algumas vantagens em comparação com a edição do genoma zigoto, especialmente para KI de DNA longo. Por exemplo, a eficiência de KI de fragmentos longos de DNA (> vários kb) no genoma do zigoto é menos evidente^6,7, e muitos zigotos são necessários para desenvolver até mesmo uma linha de camundongo KI^, o que é indesejável na perspectiva atual de experimentos com animais. Em contraste com a edição do genoma do zigoto, o DNA longo direcionado para ESCs seguido pela produção de quimera precisa de significativamente menos embriões do que a edição do genoma zigoto. Além disso, embora os embriões pré-implantação de BALB/c sejam suscetíveis à manipulação in vitro, seus ESCs podem ser mantidos e manuseados in vitro¹¹ como outros ESCs de fundo 129 ou F1 competentes, portanto, aplicáveis às produções de quimera. No entanto, mesmo que um vetor alvo contenha braços homólogos de 5' e 3' e gênicas de resistência a medicamentos para seleção positiva ou negativa, a eficiência convencional de KI de ESCs é geralmente insuficiente, devido à alta frequência de integração genômica aleatória ^8,10, Assim, é necessário um método aprimorado com eficiência precisa de direcionamento de ESC. Recentemente, relatamos um método ESC KI ajustado usando edição de genoma baseada em CRISPR/Cas9 para alcançar maior eficiência de KI do que os métodos convencionais de segmentação¹¹. O método que descrevemos aqui é baseado neste procedimento que permite DNA longo (> vários a 10 kb) KI para ESCs com eficiência aceitável para trabalhos de rotina sem seleção de drogas; assim, o procedimento de construção vetorial seria muito mais fácil e precisaria de um período mais curto, ou o período de cultura celular também se tornaria significativamente mais curto.

Protocolo

Todos os experimentos com ratos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Tóquio (número de aprovação PA17-63) e da Universidade de Osaka (número de aprovação Biken-AP-H30-01) e realizados de acordo com suas diretrizes, bem como as diretrizes ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

1. Visando a construção de vetores

1. Amplificar uma de KI (CreERT aqui, o DNA modelo para a PCR é originalmente de uma empresa comercial de síntese de genes) e um fragmento aproximado de 1 kb de braços de homologia de 5 'ou 3' por PCR. Para clonagem de DNA (etapa 1.3), adicione sequências de sobreposição de 15 meros na extremidade de 5' de cada primer de PCR. Purificar os fragmentos de DNA por PCR por eletroforese em gel de agarose, seguida de extração do fragmento de DNA usando um kit de purificação de DNA.
2. Linearize o plasmídeo da espinha dorsal (por exemplo, pUC19 ou pBS) usando uma enzima de restrição apropriada que digere exclusivamente em algum lugar no local de multiclonagem para clonagem. Em seguida, purifique o plasmídeo digerido usando um kit de purificação de DNA.
3. Clone cada fragmento de PCR (por exemplo, braço de homologia 5', braço de homologia 3') e sequência de KI simultaneamente no plasmídeo digerido usando um kit de clonagem de DNA de acordo com as instruções do fabricante.
4. Transformar as células competentes utilizando o plasmídeo construído (passo 1.3) aquecendo a 42 °C durante 1 minuto em banho-maria e, em seguida, semeá-las numa placa LB contendo a concentração adequada de antibióticos, tais como ampicilina ou canamicina. Cultive-os durante a noite para seleções de clones resistentes.
5. Apanhar várias (quatro a oito) colónias individuais utilizando pontas de pipeta de 200 μL e transferir as pontas para 3 ml de LB líquido contendo antibióticos apropriados (100 μg/ml de ampicilina ou 20 μL/ml de canamicina) e cultivar durante a noite a 37 °C com agitação.
6. Purifice o plasmídeo no dia seguinte usando um kit de purificação de plasmídeo comercial de grau livre de endotoxinas de acordo com as instruções do fabricante. Confirme a sequência clonada no plasmídeo pelo sequenciamento de Sanger. Ajustar a concentração plasmídica a 1 μg de ADN/μL utilizando água isenta de nuclease. Use o plasmídeo como o vetor de direcionamento do gene.

2. Preparação do fibroblasto embrionário do rato (MEF) como células alimentadoras para ESC

1. Sacrificar camundongos fêmeas de RCI grávidas de 8 a 10 semanas de idade (14,5 dias pós-coito) por luxação cervical. Limpe bem o abdômen usando etanol a 70% (v / v) para esterilização, corte o abdômen usando tesouras orbitais e fórceps e recupere o útero contendo o feto.
2. Coloque o útero em um prato de 100 mm contendo 10 mL de soro bovino fosfato (PBS) contendo 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Remova as placentas e os tecidos extraembrionários dos fetos usando tesouras orbitais e fórceps. Pice os fetos usando uma tesoura orbital e transfira a solução de PBS contendo as células fetais picadas para um tubo cônico de 50 mL.
3. Centrifugar a 280 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante por aspiração. Adicionar 10 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% (p/v), misturar bem por pipetagem e, em seguida, incubar durante 10 minutos a 37 °C utilizando banho-maria para digestão da tripsina.
4. Adicionar 20 mL de meio MEF (DMEM contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) para interromper a reação enzimática, misturar bem por inversão suave e centrifugar a 280 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por aspiração, adicione 10 mL de meio MEF e misture bem por pipetagem.
5. Semeia a suspensão celular em várias novas placas de 100 mm (prepare o mesmo número de pratos que o número de fetos com 10 mL de meio MEF para um prato de 100 mm). Mude o meio 4 a 5 h após a semeadura para remover as células desanexadas e deixe o MEF anexado crescer. Passe as células quando elas atingirem ~80% de confluência usando tripsina.
6. Colocar as placas de cultura contendo o MEF proliferante em meio MEF, aproximadamente 12-15 dias após a semeadura, em um dispositivo de irradiação de raios-X. Exponha o MEF com um raio-X de 50 Gy (total) para interromper o ciclo celular de acordo com as instruções do fabricante.
7. Tripsinize o MEF irradiado adicionando 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% para um prato de 100 mm por 5 min a 37 °C, depois adicione 4 mL de meio MEF para interromper a digestão da tripsina e coletar a suspensão celular em um novo tubo de 50 mL.
8. Lavar o MEF com um meio MEF fresco por centrifugação a 280 x g durante 5 min a 4 °C, contar o número de células utilizando um contador celular com coloração azul de tripano e congelá-las a 1,6 x 10⁶ células/tubo num meio de congelação celular. Armazenar até o uso; as células podem ser armazenadas de forma estável em nitrogênio líquido por vários anos.

3. Preparação da mistura Cas9-RNP-DNA

1. Dissolver tracrRNA e crisprRNA em tampão de diluição (cada concentração de RNA a 200 μM) por pipetagem. Misturar a solução de tracrRNA, a solução de crisprRNA e o tampão de diluição (relação de volume a 2:2:5) batendo suavemente e recozimento de cada RNA usando um termociclador a 95 °C por 10 min, seguido de ciclos de redução de 1 °C/min até que a temperatura atinja 4 °C.
   NOTA: A sequência de gRNA foi desenhada utilizando CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
2. Incubar os RNAs recozidos, 10 μg/μL de nuclease Cas9 e o tampão de eletroporação misturados em uma proporção de volume de 5:3:2 a 37 °C por 20 min para formar o complexo Cas9-RNP. No trabalho de rotina, misture e incube 1,25 μL de RNA recozido, 0,75 μL de nuclease Cas9 e 0,5 μL do tampão de eletroporação para edição do genoma de um locus.
3. Misture os seguintes materiais em um tubo de 1,5 mL: 10 μL de tampão de eletroporação, 1 μL de complexo Cas9-RNP (etapa 3.2) e 1 μL de vetor de direcionamento circular (1 μg/μL, etapa 1.6). A quantidade total de mistura Cas9-RNP-DNA é de 12 μL. Mantenha a mistura Cas9-RNP-DNA no gelo até a eletroporação.
   NOTA: Para evitar a reclivagem do gRNA após o KI, projete o gRNA em uma posição em que a sequência de reconhecimento do gRNA seja dividida pela integração do doador de KI. Se o gRNA não puder ser projetado em tal local, várias mutações silenciosas de nucleotídeos, pelas quais a sequência de aminoácidos não muda, são incluídas no plasmídeo do doador de KI.

4. Segmentação genética das ESCs

1. Para preparar as placas de cultura celular revestidas de gelatina, adicionar solução de gelatina a 0,1% (p/v) a 2 mL para um prato de 60 mm, 500 μL para uma placa de 24 poços, 100 μL para uma placa de 96 poços e incubar por 2 h em uma incubadora úmida. Retire a solução de gelatina, lave duas vezes com a mesma quantidade de PBS e guarde à temperatura ambiente até à utilização.
2. Descongelar mitoticamente o reservatório de MEF congelado inactivado (passo 2.2) utilizando um banho-maria de 37 °C durante 1 min e colocar o MEF num prato de 60 mm revestido de gelatina (um tubo de reserva congelado de MEF contendo 1,6 x 10⁶ células para duas placas de 60 mm, passo 2.2) 1 dia antes da semeadura ESC.
3. Descongelar um tubo de estoque ESC congelado (armazenado a 2 x 10 5 ESCs/tubo; a contagem de células foi realizada usando um contador de células) usando um banho-maria de 37 °C por 1 min e colocar 1 x 10⁵ ESCs em um prato de 60 mm contendo MEF pré-semeado (etapa 4.1).
4. Cultura em meio de cultura ESC de 4 mL (ESCM, meio modificado à base de DMEM com 15% (v/v) de soro fetal bovino, substrato de L-glutamina de 2 mM, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,1 mM de 2-mercaptoetanol, fator inibitório de leucemia e t2i (0,2 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021) que mantém a pluripotência de ESC¹¹) a 37 °C com 5% de CO₂ até que a CES atinja 50% a 70% de confluência.
   NOTA: Usamos três linhas diferentes de ESC: JM8. A3 da B6N, V6.5 da B6-129 F1 e ESC BALB/c desenvolvido internamente. Os mesmos protocolos KI neste manuscrito são utilizados para todas as linhas ESC.
5. Lave o ESC de cultura com 4 mL de PBS e, em seguida, trate com 800 μL de solução de tripsina-EDTA a 0,25% por 5 min a 37 °C para digestão. Adicione 1 mL de ESCM para inativar a tripsina e dissociar as ESCs em células individuais por pipetação.
6. Centrifugar a solução contendo ESC por 5 min a 280 x g, descartar o sobrenadante, ressuspender as ESCs em 1 mL fresco de ESCM e contar o número de células usando um contador de células com coloração azul de tripano. Transfira 1 x 10 5 ESCs para um novo tubo de^1,5 mL e lave-os três vezes com PBS por centrifugação a 500 x g, 4 °C.
7. Ressuspeite o pellet ESC em 12 μL de mistura Cas9-RNP-DNA (etapa 3.3) e misture bem por pipetagem suave para evitar borbulhamento. Sirva o ESC ressuspenso para eletroporação. O sistema de eletroporação utiliza um único pulso a 1.400 V e 30 ms para transdução de Cas9-RNP-DNA (Figura 1).
8. Culturar as ESCs eletroporadas numa placa de 60 mm contendo 4 ml de ESCM com MEF mitoticamente inativado (secção 4.2). Mude o meio todos os dias.
9. Lavar as ESCs com 4 mL de PBS 3 a 5 dias após a eletroporação, em seguida, tratar com 800 μL de tripsina-EDTA a 0,25% e cultivar a 37 °C por 5 min em incubadora úmida para digestão. Adicionar 2 mL de ESCM para interromper a digestão da tripsina e centrifugar a mistura celular a 280 x g por 5 min.
10. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as ESCs em 1 mL de ESCM fresco e conte a concentração celular usando um contador celular com coloração azul de tripano. Passagem dos ESCs a 1 x 10³ ESCs por prato de 60 mm contendo ESCM e alimentador MEF. Troque o meio todos os dias até que a colônia se recupere.
    NOTA: A razão pela qual o ESC é passado uma vez antes da coleta foi que a edição do genoma pode continuar a ocorrer após a divisão do ESC, de modo que a primeira colônia nem sempre é o clone em muitos casos. Portanto, a primeira passagem do ESC antes da coleta da colônia é um passo essencial para a coleta de clones únicos.

5. Genotipagem por PCR de ESCs visadas

1. Aspirar a ESCM da placa de cultura ESC 5 a 7 dias após a primeira passagem (etapa 4.9) e adicionar 4 mL de PBS. Pegue colônias ESC únicas com 5 μL de PBS usando uma pipeta de 20 μL sob um estereomicroscópio (ampliação de 30x a 40x). Coloque as colônias individuais em um poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços contendo 15 μL de solução de tripsina-EDTA a 0,25%.
2. Mantenha a placa de 96 poços no gelo até que 48 colônias individuais sejam recolhidas. Incubar a placa de 96 poços por 5 min em uma incubadora úmida de CO₂ a 5% a 37 °C, depois adicionar 80 μL de ESCM para interromper a digestão de tripsina e dissociar as colônias de ESC em células únicas por pipetagem.
   NOTA: Como a eficiência de KI deste método é geralmente de 10% a 50%, rotineiramente pegamos 48 clones e primeiro realizamos a genotipagem usando 24 deles. Se vários clones de KI não puderem ser obtidos neste momento, examinaremos ainda mais o KI usando os 24 clones restantes.
3. Transferir 40 μL de suspensão ESC (etapa 5) para uma placa de 96 poços isenta de alimentador revestida com gelatina contendo 50 μL de ESCM por poço para genotipagem por PCR. Transfira os 60 μL restantes de suspensão ESC para um poço em uma placa de 24 poços revestida de gelatina, que contém 500 μL de ESCM e MEF do alimentador, para fazer o estoque ESC congelado.
4. Armazene clones ESC individuais cultivados na placa de 24 poços (etapa 5.3) até atingirem 60% a 80% de confluência. Recupere clones ESC individuais por tripsinização, como mencionado acima, colete células em um novo tubo de 1,5 mL e centrifugar a 280 x g por 5 min. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender as células em 500 μL de meio de congelação celular e congelá-las utilizando um congelador profundo a -80 °C.
5. Para a genotipagem por PCR, cultura de clones ESC na placa livre de alimentador de 96 poços (etapa 5.3) até que a CES atinja mais de 90% de confluência. Retire o ESCM de cada poço por aspiração e lave duas vezes com 100 μL de PBS.
6. Aspirar o PBS e adicionar 100 μL de tampão de lise contendo proteinase K, misturar bem e transferir o lisado ESC para um novo tubo de 1,5 mL. Aquecer o lisado ESC a 65 °C durante, pelo menos, 1 h utilizando uma câmara de calor. Extrair e purificar o DNA genômico usando um método convencional de purificação de DNA fenol-clorofórmio seguido de precipitação de etanol.
7. Dissolva o DNA precipitado em 20 μL de água isenta de DNase e determine a pureza e a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Realize a PCR genômica usando conjuntos de primer específicos do locus para amplificar a região-alvo. Em seguida, verifique a sequência e escolha os clones ESC com as sequências KI desejadas.

6. Preparação de embriões em estádio de oito células e microinjecção de ESCs

1. Injete 5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) por via intraperitoneal em fêmeas adultas com RCI. Após 48 h, injete 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) nas mesmas fêmeas e, em seguida, acasale as fêmeas tratadas com hormônios com os machos ICR. Verifique o tampão copulatório na vagina no dia seguinte (dia embrionário 0,5, ED0,5).
   NOTA: Para avaliar o quimerismo por proporções de cor de pelagem, use blastocisto da cepa ICR como um receptor para um ESC que tenha fundo de cor de revestimento preto ou cutia, ou blastocisto da cepa C57BL/6 como receptor para um ESC que tenha o fundo albino.
2. Recolha o oviduto em ED1.5 e coloque-o em gotas de meio tamponada HEPES (FHM). Recupere os embriões em estágio de duas células ou quatro células lavando o oviduto com FHM usando uma agulha de lavagem inserida no infundíbulo.
3. Lave os embriões coletados movendo-os para várias gotas frescas de FHM usando uma pipeta bucal. Cultivar os embriões em 50 μL de KSOM cair em uma placa de cultura celular de 35 mm coberta com óleo mineral a 37 °C, incubadora de CO₂ a 5% por 1 dia até que o estágio de oito células ou mórula (ED2.5) seja atingido.
4. Se os embriões não forem utilizados no dia seguinte de coleta, congelá-los por vitrificação de acordo com o protocolo CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) e armazená-los em nitrogênio líquido até o uso.
5. Preparar pipetas de vidro para segurar os embriões (80-100 μm de diâmetro externo) e injeção de ESC (cerca de 13 μm de diâmetro) usando um extrator e microforja.
6. Integre uma pipeta de retenção que contenha FHM num suporte capilar ligado a um microinjetor e configurado no lado esquerdo do micromanipulador. Conecte uma pipeta de injeção a outro microinjetor e configure-a no lado direito. Alinhe as duas pipetas diretamente no campo da visão do microscópio.
7. Dispense gotas de 5 μL de polivinilpirrolidona (PVP) a 12% (p/v) em meio FHM e gotas de 5 μL de FHM na mesma tampa de uma placa de 60 mm lado a lado e cubra as gotas com óleo mineral. Transfira embriões na gota de FHM de 5 μL e adicione 1-5 μL da suspensão ESC à gota de FHM que contém embriões.
   NOTA: Deixe a suspensão ESC e MEF por 30 min no ESM de 4 mL em prato de cultura de 60mm antes da preparação da gota. Como os MEFs aderem ao fundo mais rapidamente do que os ESCs, essa incubação de 30 minutos permite a concentração de células ES não conectadas no sobrenadante.
8. Lave dentro da pipeta de injeção com PVP e, em seguida, mova-se para a gota que contém os embriões e ESCs.
9. Pegue três duplos ECS individuais que acabaram de terminar sua divisão celular (seis células) na pipeta de injeção. Segure um embrião de oito células ou de estágio mórula, que tenha completado a compactação, com a pipeta de retenção por aspiração. Faça um buraco na zona pelúcida com um pulso piezoelétrico (intensidade: 3; velocidade: 3). Expulse o ESC de seis células dentro da zona pelúcida e puxe a pipeta para fora dos embriões.
10. Lave os embriões injetados em ESC com várias gotas de KSOM suavemente usando uma pipeta bucal e incube-os em uma nova gota de KSOM de 50 μL coberta com óleo mineral a 37 °C, 5% de CO₂ até que os embriões se desenvolvam para o estágio de blastocisto.
11. Transfira os 10 blastocistos injetados por ESC para cada corno uterino de camundongos fêmeas pseudoprenhes (2,5 dias após o coito, 20 blastocistos por cabeça).
12. Após a mãe substituta ter dado à luz, selecione pelo menos duas quimeras masculinas com a maior razão de quimerismo (70% ou mais, conforme confirmado pela cor da pelagem) e, em seguida, acasale-as com fêmeas de cepa apropriadas para obter KI heterozigoto F1.
13. Reproduza camundongos KI individuais com parceiros apropriados para obter camundongos com genótipo(s) desejável(is) ou antecedentes genéticos adequados para pesquisa.

Resultados

Direcionamos gene(s) específico(s) no CES seguido pela produção de quimeras para desenvolver a produção de camundongos manipulados por genes, de acordo com nosso manuscrito anterior¹¹. A genotipagem ESC (descrita na secção 4) é rotineiramente realizada por PCR utilizando primers. Os primers são projetados em sequências genômicas fora dos braços de homologia e nas sequências específicas no fragmento de DNA KI (Figura 2A). Nesse caso, nenhum alelo do tipo selvagem é amplificado, enquanto um amplificador de PCR de um tamanho específico é detectado apenas quando o DNA exógeno alvo é KI no locus alvo. Os resultados representativos da PCR de genotipagem são mostrados na Figura 2B. Nove dos 22 clones (40,9%) apresentaram uma banda específica de IC neste caso. Três resultados representativos de segmentação, incluindo o resultado mostrado na Figura 2, são apresentados na Tabela 1. Esses resultados indicam que o método aqui apresentado é eficiente e reprodutível para o gene KI sem nenhuma seleção de fármacos.

O ESC é captado em uma pipeta de injeção, então um orifício na zona pelúcida é feito usando um plus piezoelétrico, e o ESC é liberado entre as células embrionárias (Figura 3). Tecnicamente, este protocolo para injetar um ESC em um embrião de oito células ou estágio de mórula é semelhante ao protocolo para injeção de ESC em um blastocisto comumente usado em muitas instalações de camundongos. Camundongos quiméricos representativos são mostrados na Figura 4. Para a avaliação da cor da pelagem do quimerismo, o embrião da cepa ICR (albino, cabelos brancos) foi utilizado como receptor de CES B6 ou B6-129 F1, e embriões B6 foram utilizados como receptores de ESCs BALB/c (Figura 4).

Figura 1: Um esquema de integração de plasmídeo circular mediado por ribonucleoproteína (RNP) CRISPR/Cas9 no locus específico de um genoma ESC. A eletroporação introduz um plasmídeo circular como um vetor alvo em ESCs com Cas9-RNP. Abreviaturas: GOI = gene de interesse, HA = braço de homologia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análises genômicas de PCR para triagem de KI de clones ESC alvo. (A) Os primers de PCR específicos de KI são projetados em sequências genômicas fora dos braços de homologia (para frente) e nas sequências específicas no fragmento de DNA KI (reverso). (B) Resultados representativos de PCR de genotipagem. Um genoma do tipo selvagem foi usado como um controle negativo. Abreviaturas: GOI = gene de interesse, HA = braço de homologia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas da injeção embrionária em estágio de oito células. (A) Para microinjeção, três duplos de ESCs (seis células, pontas de seta) são captados. (B) Um orifício na zona pelúcida é feito com um pulso piezoelétrico, e os ESCs são expelidos entre cada blastômero. A barra de escala mostrada é de 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas de camundongos quimera . (A,B) O ESC derivado de C57BL/6N (JM8. A3, cabelo de cutia; A) ou B6-129 F1 (cabelo de cutia; B) são injetados em embriões ICR (albino, cabelos brancos), seguidos de transferência dos embriões para as mães de aluguel. (C) O ESC derivado de BALB/c (albino, cabelo branco) é injetado em embriões C57BL/6J (cabelo preto), seguido da transferência dos embriões para mães de aluguel. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ID do projeto	Coromossomo	5'HA comprimento (bp)	3'HA comprimento (bp)	Tamanho da inserção (pb)	Número de clones analisados	Número de clones de KI	Eficiência (%)	Observações
R26-CC*	Chr6	965	1006	5321	23	2	8.7%	-
R4-03*	Chr8	1000	997	3070	22	6	27.3%	-
P4-01*	Chr15	1000	1000	2569	22	9	40.9%	Mostrado na Figura 2

Tabela 1: Eficiências de KI em três loci genômicos independentes no CES. *Estes projetos não foram publicados até agora. O nome desses genes será divulgado em manuscritos independentes no futuro.

Discussão

O direcionamento genético de ESCs seguido pela produção de quimera tem sido convencionalmente usado para o desenvolvimento de camundongos manipulados por genes. No entanto, a eficiência de knock-in do gene permanece baixa, embora o vetor alvo contenha braços de homologia longos (> vários kb no normal) com gênicas de seleção de drogas positivas ou negativas. Nosso protocolo introduziu um método ESC KI ajustado de DNA exógeno longo usando um plasmídeo circular sem de seleção de drogas como um vetor alvo acompanhado por edição de genoma mediada por Cas9-RNP com uma eficiência aceitável para trabalhos de rotina. Assim, este protocolo poderia ajudar a reduzir substancialmente a quantidade de tempo necessário na produção de camundongos quiméricos geneticamente modificados em comparação com a segmentação ESC convencional.

Neste protocolo, usamos CRISPR/Cas9-RNP para induzir quebras de fita dupla específicas do sítio no genoma, e um plasmídeo circular foi usado como vetor alvo em vez de linearizado. Plasmídeos linearizados são convencionalmente utilizados como vetor alvo do gene KI devido à sua maior eficiência de integração genômica ^8,9,10. No entanto, muitas integrações genômicas são inespecíficas, embora o vetor contenha braços homólogos⁹. Por outro lado, plasmídeos circulares raramente são usados como vetores alvo devido à sua característica de difícil integração no genoma das ESCs¹² ou fibroblastos¹³. Assim, seria possível que a aplicação de um plasmídeo circular como um vetor alvo acompanhado pela edição do genoma mediado por CRISPR/Cas9 minimizasse a integração aleatória inespecífica, mas maximizasse a integração específica do local no genoma ESC. Seria notável que a eficiência de indução da quebra de fita dupla por CRISPR/Cas9 é bastante importante¹⁴, portanto, seria essencial usar o gRNA que induz uma quebra de fita dupla com alta eficiência. Deve-se considerar redesenhar o gRNA quando a eficiência do KI é muito baixa. No caso apresentado na Figura 2, 40,9% dos clones ESC apresentaram banda específica para KI. De fato, como o laboratório central do instituto, realizamos rotineiramente a segmentação de genes usando ESCs pelo método descrito aqui e alcançamos eficiências de KI de 10% a 50% para sequências de 1-2 kb, como Cre, CreRET ou repórteres fluorescentes, embora existam algumas variações dependendo do locus genético. As sequências de DNA mais longas que temos com sucesso usando este método é de cerca de 11,2 kb no locus Rosa26, e a eficiência foi de 12,2% (cinco colônias de KI de 41 colônias analisadas).

Também seria digno de nota que este protocolo usa embriões de oito células ou em estágio de mórula como receptores para microinjeção ESC, mas não embriões em estágio de blastocisto. Embora não tenhamos realizado experimentos comparativos neste trabalho, vários relatos mostraram que a injeção de ESCs em embriões de oito células ou em estágio de mórula melhora significativamente a eficiência da contribuição da ESC para a prole quimérica em comparação com a injeção de ESC em blastocistos^15,16,17,18 . De fato, as injeções ESC de várias linhas ESC, incluindo C57BL/6, B6-129 F1 e BALB/c, geralmente resultaram no desenvolvimento de quimera de alta cor de pelagem em alguns, mas não em todos, os descendentes (ver Figura 4). A limitação do método é que as CES injetadas no embrião pré-implantacional nem sempre poderiam contribuir para as células germinativas de uma quimera^19,20. A transmissão germinativa de ESCs dependeria da qualidade de cada clone ESC¹⁹. Portanto, seria vantajoso desenvolver várias linhas de clones ESC como um backup para a produção estável de camundongos quiméricos. Em conclusão, os protocolos aqui apresentados utilizam vetores de segmentação simples que incluem apenas cada braço de homologia e gene de interesse para KI sem qualquer resistente a medicamentos. Portanto, a construção do vetor seria muito mais fácil, e o período de cultura poderia ser encurtado em comparação com a técnica convencional de segmentação ESC. Isso ajudaria na produção rápida e facilitadora de vários tipos de camundongos geneticamente modificados para futuras análises em ciências da vida.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c ESC	-	-	ESC developed from BALB/c strain
Bambanker	Nippon Genetics	CS-02-001	Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere
Cas9 Nuclease V3	IDT	1081059	Section 3.2 and elsewhere.
CHIR99021	FUJIFILM Wako	038-23101	Section 4.3
CreERT gene fragment	GeneWiz		Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA	IDT		crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.
CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072534	tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.
DMEM	Nacalai	08458-45	MEF medium. Section 2.3 and elsewhere
Duplex buffer	IDT	1072534	RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.
FastGene Gel/PCR Extraction Kit	Nippon Genetics	FG-91302	Section 1.1 and 1.2.
GlutaMax	Thermo Fisher	35-050-061	L-glutatime substrate
hCG	ASKA Animal Health		Section 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit	Clontech	639648	DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere
JM8.A3 ESC	EuMMCR	-	ESC developed from C57BL/6N strain
Knock-out DMEM	Thermo Fisher	10829018	Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.
KSOM	Merck	MR-121-D	Section 6.3 and 6.9.
Leukemia inhibitory factor	FUJIFILM Wako	125-05603	Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.
Neon Electroporation system	Thermo Fisher	MPK5000	Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade	Takara	U0490B	Section 1.6.
PD0325901	FUJIFILM Wako	162-25291	Section 4.3
PMSG	ASKA Animal Health		Section 6.1.
Tail lysis buffer	Nacalai	06169-95	Section 5.5.
Trypsin-EDTA	Nacalai	32777-15	Section 2.2 and elsewhere
V6.5 ESC	-	-	ESC developed from B6J-129 F1 strain
X-ray irradiation device	Hitachi	MBR-1618R-BE	Section 2.6.