Realistische Membranmodellierung anhand komplexer Lipidmischungen in Simulationsstudien

Zusammenfassung

Die Lipidvielfalt der Membran in Struktur und Zusammensetzung ist ein wichtiger Faktor für zelluläre Prozesse und kann ein Marker für Krankheiten sein. Molekulardynamik-Simulationen ermöglichen es uns, Membranen und ihre Wechselwirkungen mit Biomolekülen mit atomistischer Auflösung zu untersuchen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um komplexe Membransysteme zu bauen, zu betreiben und zu analysieren.

Zusammenfassung

Lipide sind strukturelle Bausteine von Zellmembranen; Die Lipidspezies variieren zwischen den Zellorganellen und zwischen den Organismen. Diese Vielfalt führt zu unterschiedlichen mechanischen und strukturellen Eigenschaften in der Membran, die sich direkt auf die Moleküle und Prozesse auswirken, die an dieser Grenzfläche ablaufen. Die Zusammensetzung der Lipide ist dynamisch und kann dazu dienen, Signalprozesse in der Zelle zu modulieren. Computergestützte Ansätze werden zunehmend eingesetzt, um Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen vorherzusagen und molekulare Einblicke in experimentelle Observablen zu liefern. Molekulardynamik (MD) ist eine auf statistischer Mechanik basierende Technik, die die Bewegung von Atomen basierend auf den Kräften, die auf sie einwirken, vorhersagt. MD-Simulationen können verwendet werden, um die Wechselwirkung von Biomolekülen zu charakterisieren. Hier stellen wir die Technik kurz vor, skizzieren praktische Schritte für Anfänger, die an der Simulation von Lipiddoppelschichten interessiert sind, demonstrieren das Protokoll mit einsteigerfreundlicher Software und diskutieren Alternativen, Herausforderungen und wichtige Überlegungen zum Prozess. Insbesondere betonen wir die Relevanz der Verwendung komplexer Lipidmischungen zur Modellierung einer Zellmembran von Interesse, um die geeigneten hydrophoben und mechanischen Umgebungen in der Simulation zu erfassen. Wir diskutieren auch einige Beispiele, bei denen die Zusammensetzung und die Eigenschaften der Membran die Wechselwirkungen von Doppelschichten mit anderen Biomolekülen modulieren.

Einleitung

Lipide sind Hauptbestandteile von Membranen, die den Zellen Grenzen bilden und eine intrazelluläre Kompartimentierung ermöglichen ^1,2,3. Lipide sind amphiphil, mit einer polaren Kopfgruppe und zwei hydrophoben Fettsäureschwänzen; Diese fügen sich selbst zu einer Doppelschicht zusammen, um den Kontakt der hydrophoben Ketten mit Wasser zu minimieren ^3,4. Verschiedene Kombinationen von hydrophilen Kopfgruppen und hydrophoben Schwänzen führen zu unterschiedlichen Klassen von Lipiden in biologischen Membranen, wie z. B. Glycerophospholipide, Sphingolipide und Sterole (Abbildung 1)^1,5,6. Glycerophospholipide sind primäre Bausteine eukaryotischer Zellmembranen, die aus Glycerophosphat, langkettigen Fettsäuren und Kopfgruppen mit niedrigem Molekulargewicht^{bestehen 7}. Die Lipidnomenklatur basiert auf Unterschieden in den Kopfgruppen; Beispiele hierfür sind Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidyl-Ethanolamin (PE), Phosphatidyl-Serin (PS), Phosphatidyl-Glycerin (PG), Phosphatidyl-Inositol (PI) oder die unmodifizierte Phosphatidsäure (PA)^5,6. Bei hydrophoben Schwänzen variieren die Länge und der Sättigungsgrad sowie die Struktur des Rückgrats. Die möglichen Kombinationen sind zahlreich, was zu Tausenden von Lipidspezies in Säugetierzellen führt⁶. Veränderungen in der Zusammensetzung der Membranlipide führen zu unterschiedlichen mechanischen und strukturellen Membraneigenschaften, die sich auf die Aktivität sowohl der integralen Membranproteine als auch der peripheren Proteine auswirken ^2,6.

Abbildung 1. Repräsentative Lipidstrukturen. Fettsäureschwänze sind in blauen Kästchen, häufige Lipidkopfgruppen in Orange und Probenrückgrate in Lila dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Lipide sind aktive Akteure in zellulären Prozessen, Proteinaktivierung in Signalkaskaden und gesunder Zellhomöostase ^8,9. Eine veränderte Lipiddynamik ist die Folge einer Infektion oder kann Marker für die Pathogenese der Erkrankung sein 10,11,12,13,14,15. Als Barrieren für die Zelle ist die Untersuchung von Membranlipiden und ihrer Rolle bei der Permeation kleiner Moleküle von Bedeutung für Arzneimittelverabreichungssysteme und Membranaufschlussmechanismen ^16,17. Chemische Vielfalt und unterschiedliche Verhältnisse von Lipidspezies in Organellen, Geweben und Organismen führen zu einer komplexen Membrandynamik². Daher ist es wichtig, diese Eigenschaften bei Modellierungsstudien von Lipiddoppelschichten beizubehalten, insbesondere wenn das Ziel einer Studie darin besteht, Wechselwirkungen anderer Biomoleküle mit der Membran zu untersuchen. Welche Lipidspezies in einem Modell zu berücksichtigen sind, hängt vom Organismus und dem Zellkompartiment ab, das von Interesse ist. Zum Beispiel sind PG-Lipide wichtig für den Elektronentransfer in photosynthetischen Baterien¹⁸, während phosphorylierte Inositol-Lipide (PIPs) wichtige Akteure bei der Dynamik der Plasmamembran (PM) und den Signalkaskaden in Säugetierzellen sind^19,20. Im Inneren der Zelle enthalten das PM, das endoplasmatische Retikulum (ER), der Golgi und die mitochondrialen Membranen einzigartige Lipidhäufigkeiten, die ihre Funktion beeinflussen. Zum Beispiel ist das ER die Drehscheibe für die Lipidbiogenese und transportiert Cholesterin zu PM und Golgi; Es enthält eine hohe Lipidvielfalt mit einer Fülle von PC und PE, aber einen niedrigen Sterolgehalt, der die Membranfluidität fördert^21,22,23,24. Im Gegensatz dazu enthält die PM je nach Organismus Hunderte und sogar Tausende von Lipidspezies²⁵, sie enthält hohe Konzentrationen von Sphingolipiden und Cholesterin, die ihr eine charakteristische Steifigkeit im Vergleich zu anderen Membranen in der Zelle verleihen²⁴. Die Asymmetrie des Segels sollte für Membranen wie die PM in Betracht gezogen werden, die ein äußeres Segel hat, das reich an Sphingomyelin, PC und Cholesterin ist, und ein inneres Segel, das reich an PE, PI und PS ist, die für Signalkaskaden wichtig sind²⁴. Schließlich führt die Lipidvielfalt auch zur Bildung von Mikrodomänen, die sich in Packung und innerer Ordnung unterscheiden, die als Lipid-Rafts bekannt^{sind 24,26}; Diese weisen eine laterale Asymmetrie auf, es wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei der zellulären Signalübertragung^{spielen 26}, und sind aufgrund ihrer vorübergehenden Natur schwer zu untersuchen.

Experimentelle Techniken wie Fluoroskopie, Spektroskopie und Modellmembransysteme wie riesige unilamellare Vesikel (GUVs) wurden verwendet, um Wechselwirkungen von Biomolekülen mit Membranen zu untersuchen. Die Komplexität und Dynamik der beteiligten Komponenten lässt sich jedoch nur schwer mit experimentellen Methoden erfassen. Zum Beispiel gibt es Einschränkungen bei der Abbildung von Transmembrandomänen von Proteinen, der Komplexität von Membranen, die in solchen Studien verwendet werden, und der Identifizierung von intermediären oder vorübergehenden Zuständen während des interessierenden Prozesses^27,28,29. Seit dem Aufkommen der molekularen Simulation von Lipid-Mono- und Doppelschichten in den 1980er Jahren²⁹ können Lipid-Protein-Systeme und ihre Wechselwirkungen auf molekularer Ebene quantifiziert werden. Die Molekulardynamik-Simulation (MD) ist eine gängige Berechnungstechnik, die die Bewegung von Partikeln auf der Grundlage ihrer intermolekularen Kräfte vorhersagt. Ein additives Wechselwirkungspotential beschreibt die gebundenen und nicht gebundenen Wechselwirkungen zwischen Teilchen des Systems³⁰. Der Satz von Parametern, die zur Modellierung dieser Wechselwirkungen verwendet werden, wird als Simulationskraftfeld (FF) bezeichnet. Diese Parameter werden aus ab initio-Berechnungen, semi-empirischen und quantenmechanischen Berechnungen gewonnen und optimiert, um unter anderem Daten aus Röntgen- und Elektronenbeugungsexperimenten, NMR-, Infrarot-, Raman- und Neutronenspektroskopie zu reproduzieren³¹.

MD-Simulationen können verwendet werden, um Systeme mit verschiedenen Auflösungsstufen^{zu untersuchen 32,33,34}. Systeme, die darauf abzielen, spezifische biomolekulare Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und andere hochauflösende Details zu charakterisieren, werden mit All-Atom-Simulationen (AA) untersucht. Im Gegensatz dazu werden bei grobkörnigen (CG) Simulationen Atome in größere funktionelle Gruppen zusammengefasst, um den Rechenaufwand zu senken und die Dynamik auf größerer Skala zu untersuchen³³. Dazwischen befinden sich United-Atom (UA)-Simulationen, bei denen Wasserstoffatome mit ihren jeweiligen schweren Atomen kombiniert werden, um die Berechnung zu beschleunigen^33,35. MD-Simulationen sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erforschung der Dynamik von Lipidmembranen und ihrer Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und können dazu dienen, Mechanismen auf molekularer Ebene für Prozesse von Interesse an der Membranschnittstelle bereitzustellen. Darüber hinaus können MD-Simulationen dazu dienen, experimentelle Ziele einzugrenzen und makromolekulare Eigenschaften eines bestimmten Systems auf der Grundlage mikroskopischer Wechselwirkungen vorherzusagen.

Kurz gesagt, bei einer Reihe von Anfangskoordinaten, Geschwindigkeiten und einer Reihe von Bedingungen wie konstanter Temperatur und konstantem Druck werden Positionen und Geschwindigkeiten jedes Teilchens durch numerische Integration des Wechselwirkungspotentials und des Newtonschen Bewegungsgesetzes berechnet. Dies wird iterativ wiederholt, wodurch eine Simulationstrajektorie³⁰ erzeugt wird. Diese Berechnungen werden mit einer MD-Engine durchgeführt. Unter mehreren Open-Source-Paketen ist GROMACS³⁶ eine der am häufigsten verwendeten Engines und diejenige, die wir hier beschreiben. Es enthält auch Werkzeuge für die Analyse und Konstruktion der Anfangskoordinaten der zu simulierenden Systeme³⁷. Weitere MD-Motoren sind NAMD³⁸; CHARMM³⁹ und AMBER⁴⁰, die der Benutzer nach eigenem Ermessen basierend auf der Rechenleistung eines bestimmten Systems auswählen kann. Es ist wichtig, die Trajektorien während der Simulation sowie für die Analyse und Interpretation der Ergebnisse zu visualisieren. Es steht eine Vielzahl von Werkzeugen zur Verfügung; Hier diskutieren wir die visuelle Molekulardynamik (VMD), die eine breite Palette von Funktionen bietet, einschließlich dreidimensionaler (3D) Visualisierung mit umfangreichen Zeichen- und Färbemethoden, volumetrischer Datenvisualisierung, Erstellen, Vorbereiten und Analysieren von Trajektorien von MD-Simulationssystemen und Erstellen von Trajektorienfilmen ohne Begrenzung der Systemgröße, wenn der Speicher verfügbar ist^41,42,43.

Die Genauigkeit der vorhergesagten Dynamik zwischen den Systemkomponenten wird direkt durch die FF beeinflusst, die für die Ausbreitung der Trajektorie gewählt wird. Empirische FF-Parametrisierungsbemühungen werden von wenigen Forschungsgruppen verfolgt. Zu den etabliertesten und gebräuchlichsten FF für MD gehören CHARMM³⁹, AMBER 40, Martini⁴⁴, OPLS 45 und SIRAH ⁴⁶. Das Vollatom-Additiv CHARMM36 (C36) Kraftfeld⁴⁷ wird häufig für AA MD von Membransystemen verwendet, da es experimentelle Strukturdaten genau reproduziert. Es wurde ursprünglich von der CHARMM-Community entwickelt und ist mit mehreren MD-Engines wie GROMACS und NAMD kompatibel. Trotz Verbesserungen in den gängigen FFs gibt es kontinuierliche Bemühungen, die Parametersätze zu verbessern, um Vorhersagen zu ermöglichen, die experimentelle Observablen genau reproduzieren, angetrieben von Interessen an bestimmten Studiensystemen^48,49.

Eine Herausforderung bei der Simulation von Lipidmembranen ist die Bestimmung der Länge der Simulationstrajektorie. Dies hängt weitgehend von den zu analysierenden Metriken und dem Prozess ab, den man charakterisieren möchte. Typischerweise benötigen komplexe Lipidmischungen mehr Zeit, um ein Gleichgewicht zu erreichen, da mehr Spezies genügend Zeit haben müssen, um auf der Membranebene zu diffundieren und eine stabile laterale Organisation zu erreichen. Eine Simulation befindet sich im Gleichgewicht, wenn die interessierende Eigenschaft ein Plateau erreicht hat und um einen konstanten Wert schwankt. Es ist gängige Praxis, mindestens 100-200 ns äquilibrierte Trajektorie zu erhalten, um eine angemessene statistische Analyse der interessierenden Eigenschaften und Wechselwirkungen durchzuführen. Es ist üblich, reine Membransimulationen zwischen 200 und 500 ns durchzuführen, abhängig von der Komplexität der Lipidmischung und der Forschungsfrage. Protein-Lipid-Wechselwirkungen erfordern typischerweise längere Simulationszeiten zwischen 500 und 2000 ns. Einige Ansätze zur Beschleunigung der Probenahme und der beobachtbaren Dynamik mit Membransystemen sind: (i) das hochmobile membranmimetische (HMMM) Modell, bei dem Endkohlenstoffe von Lipiden in der Membran durch organische Lösungsmittel ersetzt werden, um die Probenahme zu beschleunigen⁵⁰; und (ii) Wasserstoffmassenumverteilung (HMR), die einen Bruchteil der Massen schwerer Atome innerhalb eines Systems mit denen von Wasserstoffatomen kombiniert, um die Verwendung eines größeren Simulationszeitschritts⁵¹ zu ermöglichen.

Das folgende Protokoll erläutert einen anfängerfreundlichen Ansatz zum Erstellen, Ausführen und Analysieren realistischer Membranmodelle mit AA MD. Aufgrund der Beschaffenheit von MD-Simulationen müssen mehrere Trajektorien ausgeführt werden, um die Reproduzierbarkeit und eine ordnungsgemäße statistische Analyse der Ergebnisse zu gewährleisten. Es ist gängige Praxis, mindestens drei Replikate pro relevantem System auszuführen. Sobald die Lipidspezies für den interessierenden Organismus und Prozess ausgewählt wurden, werden grundlegende Schritte zum Aufbau, Ausführen und Analysieren einer Simulationstrajektorie eines reinen Membransystems skizziert und in Abbildung 2 zusammengefasst.

Abbildung 2. Schaltplan zum Ausführen von MD-Simulationen. Orangefarbene Kästchen entsprechen den drei Hauptschritten, die im Protokoll beschrieben sind. Darunter befindet sich der Workflow des Simulationsprozesses. Während des Systemaufbaus wird das System, das die Anfangskoordinaten eines solvatisierten Membransystems enthält, mit einem Systemeingabegenerator wie CHARMM-GUI Membrane Builder erstellt. Nach der Übertragung der Eingabedateien in einen High-Performance-Computing-Cluster wird die Simulationstrajektorie mit einer MD-Engine wie GROMACS weitergegeben. Die Trajektorienanalyse kann zusammen mit der Visualisierung auf dem Computercluster oder einer lokalen Arbeitsstation durchgeführt werden. Die Analyse wird dann entweder mithilfe von Paketen mit integriertem Analysecode wie GROMACS und VMD oder mithilfe von Bash-Skripten oder verschiedenen Python-Bibliotheken durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

1. Erstellen der Systemkoordinaten

1. Navigieren Sie mit einem Webbrowser zu CHARMM-GUI.org (C-GUI). Navigieren Sie im oberen Menü zu Input Generator und wählen Sie dann Membrane Builder aus den vertikalen Optionen auf der linken Seite des Bildschirms aus.
2. Um einen Bilayer zu erstellen, wählen Sie Bilayer Builder aus.
   HINWEIS: Erstbenutzer müssen ihr kostenloses Konto aktivieren, bevor sie ihren ersten Koordinatensatz erstellen.
3. Wählen Sie Nur Membransystem aus. Speichern Sie die generierte JOB-ID, um das System abzurufen, und fahren Sie bei Bedarf an der Stelle fort, an der Sie während des Vorgangs aufgehört haben.
   1. Visualisieren Sie die Systeme in jedem Schritt des Bauprozesses, indem Sie im Feld oben auf der Seite auf Struktur anzeigen klicken oder die resultierende PDB-Datei herunterladen. Achten Sie auf fehlende Komponenten, Fehler in der ausgewählten Eingangslipidspezies oder Patchgröße.
4. Wählen Sie die Komponenten des Systems aus.
   1. Wählen Sie die Option "Heterogenes Lipid", auch wenn Sie eine einkomponentige Doppelschicht aufbauen. und wählen Sie dann einen rechteckigen Box-Typ aus.
   2. Wählen Sie 45 Wassermoleküle pro Lipid für die Hydratationsoption; Dies ist ausreichend, um eine vollständig hydratisierte Doppelschicht zu gewährleisten.
   3. Stellen Sie die Länge von XY so ein, dass sie auf der Anzahl der Lipidkomponenten basiert. Wählen Sie dann die Anzahl der Lipide aus, die für jede Lipidspezies einbezogen werden sollen, die vor dem Modell bestimmt wurde. Für die im nächsten Abschnitt diskutierte Fallstudie wurde ein Membranmodell mit 600 symmetrisch in zwei Segeln verteilten Lipiden erstellt. Um die ER von eukaryotischen Zellen zu modellieren, wurde eine Mischung aus 336 DOPC-, 132 DPPE-, 60 CHOL- und 72 POPI-Lipiden für das PI-Modell verwendet; und 330 DOPC-, 126 DPPE-, 54 CHOL-, 66 POPI- und 24 DOPS-Lipide für das PI-PS-Modell.
      HINWEIS: C-GUI bietet eine Bibliothek von Lipidstrukturen zur Auswahl; Klicken Sie auf die Bilder neben dem Artnamen für seine chemische Struktur.
   4. Geben Sie die gewünschte Anzahl von Molekülen in der oberen und unteren Packungsbeilage in die beiden Felder neben dem Lipidnamen ein. Für die Fallstudie ist eine symmetrische Membranzusammensetzung gewünscht - stellen Sie sicher, dass es keine Fehler in Bezug auf eine unübertroffene Anzahl von Lipiden in der oberen und unteren Faltblätter gibt. Wenn eine Asymmetrie gewünscht ist, stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Lipide in jedem Packungsbeilage korrekt ist. Für Details zum Aufbau asymmetrischer Doppelschichten siehe die Arbeit von Park et ^al.52,53.
   5. Gehen Sie zum Anfang der Liste der Lipidspezies und klicken Sie auf die Schaltfläche Systeminformationen anzeigen. Bauen Sie Komponenten zusammen und vervollständigen Sie das System.
   6. Wählen Sie die Option zum Einbeziehen neutralisierender Ionen unter Verwendung des entfernungsbasierten Algorithmus für eine schnellere Konvergenz⁵⁴ aus.
   7. Belassen Sie die Standardlösungskonzentration von KCl bei 0,15 mM. Dies ist eine typische Salzkonzentration, um die Simulationsbox für Membrandoppelschichten neutral zu machen.
      HINWEIS: Wenn eine andere Konzentration verwendet werden soll, stellen Sie sicher, dass Sie nach der Bearbeitung auf die Schaltfläche Lösungsmittelzusammensetzung berechnen klicken.
5. Wählen Sie die Simulationsbedingungen und -einstellungen aus.
   1. Wählen Sie CHARMM36m als FF-Option aus. Es wird häufig für Lipid- und Proteinsimulationen verwendet, aber der Benutzer kann auch andere Optionen auswählen, die in der Einführung besprochen werden.
   2. Wählen Sie GROMACS als MD-Engine aus, um Beispieleingabedateien im entsprechenden Format zu erhalten.
      HINWEIS: GROMACS wird für neue Benutzer empfohlen, da es mehrere Online-Ressourcen, Tutorials und Foren für den Support bietet. Der Benutzer kann aus mehreren MD-Engines auswählen, um Optionen in Bezug auf Simulationsleistung und Codesyntax zu erkunden.
   3. Wählen Sie das NPT-Ensemble (Constant Particle-Pressure-Temperature), das bei weitem am häufigsten verwendete dynamische Ensemble bei der Simulation von Lipiddoppelschichten.
   4. Stellen Sie die Temperatur und den Druck in Kelvin und bar auf 303 K bzw. 1 bar ein. Es ist üblich, die Temperatur zwischen 298 K und 310 K einzustellen, um biologische Prozesse zu untersuchen, um eine Doppelschicht im flüssigen Unordnungszustand zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Temperatur hängt von den Bedingungen des zu simulierenden Prozesses ab und kann bei Bedarf geändert werden. Abhängig von den Lipidspezies im Modell ist die Temperatur vor dem Ausführen der Simulation so einzustellen, dass sie über der Sprungtemperatur der reinen Lipidkomponenten liegt.
6. Laden Sie die resultierenden Dateien herunter und übertragen Sie sie auf den Computercluster.
   1. Visualisieren Sie das endgültige System mit einer Software Ihrer Wahl, z. B. VMD oder PyMol, und überprüfen Sie die ordnungsgemäße Einrichtung.
      HINWEIS: Es ist z. B. gut zu überprüfen, ob genügend Wasser um die Membran herum vorhanden ist, so dass Lipide während der Simulation nicht mit Bildatomen interagieren, und den richtigen Aufbau des Segels (eine Doppelschicht ohne Raum oder Wasser dazwischen).

2. Ausführen von MD-Simulationen

1. Laden Sie die Dateien von C-GUI auf Ihren Computing-Cluster hoch und entpacken Sie sie. Navigieren Sie zum Gromacs-Verzeichnis . Erstellen Sie ein Entspannungsübermittlungsskript.
2. Befolgen Sie die Richtlinien des Clusters für das Format eines Übermittlungsskripts.
   1. Kopieren Sie die Befehle, die bis knapp über dem # Produktionskommentar in der README-Datei aufgeführt sind, in das Übermittlungsskript.
      HINWEIS: Diese Standardeinstellung von C-GUI ist eine Schleife, die eine 6-stufige Entspannung des Systems ausführt. Wenn ein anderes und gut etabliertes Protokoll gewünscht wird, bearbeiten Sie es, um die soeben erstellten und von C-GUI heruntergeladenen Koordinaten zu lesen.
3. Übermitteln Sie das Entspannungsskript und vergewissern Sie sich, dass alle Ausgabedateien für alle Schritte heruntergeladen wurden, bevor Sie mit dem Produktionslauf fortfahren. Suchen Sie nach Abschluss des Vorgangs nach den folgenden Ausgabedateien von GROMACS, die während des 6-Schritte-Laufs generiert wurden: *.log, *.tpr, *.gro, *.edr, *.trr / *.xtc
4. Erstellen Sie ein Produktionsausführungsskript.
   1. Verwenden Sie einen der Beispielbefehle gmx grompp und gmx mdrun aus einem der Entspannungsschritte als Vorlage.
   2. Bevor Sie das Skript verwenden, stellen Sie sicher, dass Sie eine *.mdp-Datei erstellen, die ähnliche Simulationsoptionen wie die bereitgestellte step7_production.mdp-Datei enthält.
      HINWEIS: Die bereitgestellten Standardoptionen sind Standard für Membransimulationen. Die Abweichungen werden in nm angegeben und die Zeit wird in Pikosekunden oder der Anzahl der Schritte (Pikosekunden / Integrationszeitschritt) angegeben. Aktualisieren Sie die nsteps so, dass sie bis zur gewünschten Simulationslänge laufen (dies ist gleich dt * nsteps) und nst[x,v,f]out, um die Häufigkeit der Datenspeicherung in der Anzahl der Integrationsschritte zu aktualisieren. Setzen Sie für die Fallstudie die nsteps auf 250.000.000 für eine Simulationslänge von 500ns (Simulationszeit / Integrationsschritt = 500.000 ps / 0,002ps) und nst[x,v,f]out auf 50.000, um Daten alle 100 ps zu speichern
5. Führen Sie vor dem Ausführen der eigentlichen Simulation Benchmark-Studien durch, um die optimale Nutzung der Ressourcen zu ermitteln.
   1. Führen Sie das System 1-2 ns lang mit einer unterschiedlichen Anzahl von Rechenknoten aus.
      HINWEIS: Die ER-Fallstudie wurde auf dem High-Performance-Computing-Cluster⁵⁵ des UB Center for Computational Research (CCR) für 2 ns eingereicht, wo die Leistung für 1-10 Knoten getestet wurde.
   2. Vergleichen Sie die Leistung in ns/Tag für jede Einstellung, um die optimalen Ressourcen für die Ausführung zu ermitteln. Es ist gängige Praxis, die Anzahl der Knoten auszuwählen, die zu 75 % bis 80 % der maximalen Leistung führen.
6. Führen Sie den Produktionslauf aus.
   1. Führen Sie jedes System dreifach aus, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, und führen Sie statistische Analysen der Daten durch.
   2. Erweitern Sie die Trajektorie basierend auf den Benchmarks, wenn die zulässige Warteschlangenzeit für die Übermittlung auf dem Computing-Cluster abgelaufen ist. Verwenden Sie die Befehle gmx convert-tpr, dann gmx mdrun, um mit der Trajektorienerfassung fortzufahren.
      HINWEIS: Die Optionen sind in der GROMACS-Dokumentation online (https://manual.gromacs.org/) beschrieben.
   3. Untersuchen Sie bei einem reinen Membransystem, ob das System ein Gleichgewicht erreicht hat, indem Sie die Fläche pro Lipid im Laufe der Zeit berechnen. Ist dies nicht der Fall, verlängern Sie die Simulationstrajektorie.

3. Analyse der Trajektorie

1. Visualisieren Sie das System, bevor Sie die Analyse durchführen, um die interessierenden Moleküle und den Teil der Trajektorie zu bestimmen, der für die Charakterisierung vorgesehen ist.
2. Komprimieren Sie rohe Trajektoriendateien (*.trr), indem Sie das Dateiformat in *.xtc ändern und/oder Frames überspringen, um die Dateigröße zu reduzieren und eine effizientere Übertragung zur lokalen Station zur Visualisierung und Analyse zu ermöglichen.
   HINWEIS: Bei großen Membransystemen kann man sich dafür entscheiden, Wasser aus der Trajektorie zu entfernen, um die Dateigröße weiter zu reduzieren. Dies kann mit Indexdateien auf GROMACS, TCL-Skripten auf VMD oder Python-Bibliotheken wie MDAnalysis und MDTraj erfolgen.
3. Führen Sie ausgewählte Analysen während des äquilibrierten Teils der Trajektorie durch, wie aus der Flächen-pro-Lipid-Zeitreihe bestimmt.
   HINWEIS: Weitere Informationen zu typischen Membrananalysen und deren Durchführung finden Sie in der Diskussion.

Ergebnisse

Um die Anwendung des Protokolls und die damit verbundenen Ergebnisse zu veranschaulichen, wird eine Vergleichsstudie für Membranmodelle für das endoplasmatische Retikulum (ER) diskutiert. Die beiden Modelle in dieser Studie waren (i) das PI-Modell, das die vier wichtigsten Lipidspezies im ER enthält, und (ii) das PI-PS-Modell, das die anionische Phosphatidylserin-Lipidspezies (PS) hinzufügte. Diese Modelle wurden später in einer Studie eines viralen Proteins und seiner Interaktion mit der Membran verwendet, wobei da...

Diskussion

Experimentelle Techniken können Biomoleküle mit hoher Auflösung unter Verwendung von Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)⁵⁸, Fluoreszenztechniken und Rasterkraftmikroskopie (AFM)⁵⁹ visualisieren. Es ist jedoch eine Herausforderung, das Zusammenspiel und die Dynamik molekularer Wechselwirkungen zu erfassen, die biologischen Signalwegen, der Krankheitspathogenese und der therapeutischen Verabreichung auf atomarer oder Aminosäureebene zugrunde liegen. Hier wurden die Mögl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaconda3	Anaconda Inc (Python & related libraries)	N/A
CHARMM-GUI.org	Im lab, Lehigh University	N/A
GROMACS	GROMACS development team	N/A
Linux HPC Cluster	UB CCR	N/A
MATLAB	MathWorks	N/A
VMD	Theoretical and Computational Biophysics Group	N/A