Duodenal-Jejunal-Bypass-Operation bei ernährungsinduzierten adipösen diabetischen Mäusen

Zusammenfassung

Eine Duodenal-Jejunal-Bypass-Operation (DJB) kann den Glukosestoffwechsel verbessern und die Insulinresistenz reduzieren. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein stabiles und zuverlässiges Mausmodell von DJB zu etablieren.

Zusammenfassung

Die Prävalenz von Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes ist ein ernstes globales Gesundheitsproblem. Fettleibigkeit ist ein wichtiger pathogener Faktor bei Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und einigen Krebsarten. Die Adipositaschirurgie bietet eine langfristige und effektive Behandlungsmöglichkeit sowohl für Fettleibigkeit als auch für Diabetes. Die Schlauchmagen-Operation (SG) und der Roux-en-Y-Magenbypass (RYGB) gelten weithin als die beliebtesten bariatrischen Operationen. Darüber hinaus haben mehrere explorative bariatrische Operationen vielversprechende therapeutische Wirkungen gezeigt. Der Duodenal-Jejunal-Bypass (DJB), der speziell auf Diabetiker mit niedrigem Body-Mass-Index zugeschnitten ist, hat positive metabolische Ergebnisse gezeigt. Die gewichtsunabhängigen metabolischen Vorteile sind jedoch aufgrund begrenzter Tiermodelle nicht vollständig verstanden. In diesem Artikel beschreiben wir die optimierten Behandlungsprotokolle und Operationstechniken für die Durchführung von DJB-Operationen bei ernährungsinduzierten adipösen (DIO) diabetischen Mäusen. Die Verwendung eines Mausmodells trägt zu einem besseren Verständnis der Art der durch die DJB-Operation induzierten Veränderungen bei und erleichtert gleichzeitig die damit verbundene klinische Praxis.

Einleitung

Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes sind die häufigsten chronischen Krankheiten der Welt, und ihre Prävalenz nimmt bei jungen Menschen zu¹. Die bariatrische Chirurgie ist die wirksamste Behandlung von Fettleibigkeit und Diabetes, da sie eine langfristige Blutzuckerstabilität ermöglicht und gleichzeitig die mit Fettleibigkeit verbundenen Komplikationen verbessert ^2,3. Es gibt verschiedene Arten der bariatrischen Chirurgie, die danach klassifiziert werden, ob sie das Magenvolumen oder die Darmabsorption reduzieren. Dazu gehören restriktiv, malabsorptiv und Kombination ^4,5.

Der Duodenal-Jejunal-Bypass (DJB) wurde erstmals von Rubino und Marescaux entwickelt, die zeigten, dass Typ-2-Diabetes durch die Verbindung von Duodenum und Jejunum und nicht durch eine Verringerung des Magenvolumens gelindert werden kann ^6,7. DJB erhält den gesamten Magen und umgeht den gesamten Zwölffingerdarm und das proximale Jejunum. Der Darm ist in biliopankreatische, Verdauungs- und gewöhnliche Gliedmaßen unterteilt ^6,8. DJB weist einige Ähnlichkeiten mit bariatrischen Operationen auf, darunter der Roux-en-Y-Magenbypass (RYGB), der Mini-Magenbypass, der biliopankreatische Bypass, die Duodenaldiversion und die DJB plus Schlauchmagen-9. Im Vergleich zu RYGB ist bei DJB keine gastrointestinale Anastomose erforderlich, was die Operationszeit verkürzt und die Erfolgsrate des Eingriffs verbessert. DJB ist ähnlich wie RYGB bei der Verbesserung des Glukosestoffwechsels, beeinflusst aber nicht das Körpergewicht¹⁰. Nach der DJB-Operation stimuliert die schnelle Nahrungsabgabe an den distalen Dünndarm die Sekretion von Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1), was zu einem verbesserten Glukosestoffwechsel führt^11,12.

Die Verwendung von Tiermodellen ist für das Verständnis der metabolischen, zellulären und molekularen Signalwege unerlässlich. Tiermodelle der bariatrischen Chirurgie haben zu unserem Verständnis möglicher Mechanismen beigetragen, die Fettleibigkeit und Diabetes zugrunde liegen^13,14. Aufgrund der physiologischen Unterschiede zwischen den Spezies ist es jedoch unmöglich, menschliche Krankheiten in Tiermodellen perfekt nachzubilden¹⁵. Unter den verschiedenen Tiermodellen, die für Forschungszwecke zur Verfügung stehen, ähnelt das Mausmodell der ernährungsinduzierten Adipositas (DIO) am ehesten der menschlichen Adipositas und dem metabolischen Syndrom¹⁶. Mäuse wurden für die DJB-Operation ausgewählt, um die Durchführbarkeit der Operation zu ermitteln und Techniken für die weitere Forschung bereitzustellen. Dieses Manuskript bietet eine umfassende Zusammenfassung sowohl der technischen Aspekte als auch der experimentellen Details der DJB-Chirurgie.

Protokoll

Alle im Folgenden beschriebenen Protokollschritte folgen den Richtlinien des Animal Care and Use Committee des General Hospital des Southern Theater Command unter der Zulassungsnummer 2020112501.

1. Allgemeine präoperative Vorbereitung

HINWEIS: Es wurden dreißig 6 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse gekauft. Die Mäuse wurden in einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Labor unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht; Temperatur, 22 ± 2 °C; und Luftfeuchtigkeit, 55-65%. Die Mäuse erhielten freien Zugang zu Wasser und erhielten 6 Wochen lang eine Diät mit 60 % kcal Fett, um Fettleibigkeit zu induzieren. Eine intraperitoneale Injektion von 40 mg/kg Streptozotocin wurde 5 Tage lang verabreicht, um Diabetes¹⁷ zu induzieren. Unter den dreißig Mäusen wurden zweiundzwanzig Mäuse auf zufällige Blutzuckerwerte > 300 mg/dl gescreent und nach dem Zufallsprinzip der DJB- (n = 15) und der Scheinchirurgie (n = 7) zugeteilt. Acht Mäuse wurden aufgrund von minderwertigem Blutzuckerspiegel vom Experiment ausgeschlossen.

1. Fasten Sie die Mäuse 8 Stunden vor der Operation. Entnehmen Sie das Wasser 2 h vor der Operation.
2. Verabreichen Sie 1% Natrium-Pentobarbital-Lösung (6 ml/kg) und Buprenorphin (1 mg/kg) intraperitoneal. Berühren Sie die Zehen oder Schwänze der Mäuse mit einer Pinzette und stellen Sie sicher, dass die Mäuse kein offensichtliches Zucken oder Zittern zeigen. Unter adäquater Narkose können die Mäuse ohne zusätzlichen Sauerstoff frei atmen.
3. Legen Sie die Mäuse in Rückenlage auf eine sterile Platte und unter ein Stereomikroskop. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf. Verwenden Sie eine Heizdecke, um die Mäuse während des gesamten Eingriffs warm zu halten. Verwenden Sie sterile Verfahren, einschließlich OP-Kittel, sterile Handschuhe und autoklavierte Instrumente.
4. Bei Scheinkontrollmäusen werden die beiden Schnitte im Zwölffingerdarm jeweils 1 cm unterhalb des Pylorus und im Jejunum 5 cm unterhalb der Treitz vorgenommen und dann die Schnitte vernäht.

2. Zwölffingerdarm-Jejunalbypass: Chirurgischer Eingriff

1. Tragen Sie die Enthaarungspaste aus dem Xiphoid auf den Bauch auf, um Haare aus diesem Bereich zu entfernen. Wischen Sie die Creme ab und stellen Sie sicher, dass die Haut sauber ist. Schrubben Sie den Bereich dreimal abwechselnd mit Jod- und Alkohollösungen.
2. Decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch ab, lassen Sie den Operationsbereich frei, und machen Sie einen 2 cm langen Schnitt vom Xiphoid bis zum Bauch.
3. Verwenden Sie einen Bauchretraktor, um die Bauchhöhle freizulegen. Schieben Sie das Bauchfett mit einem feuchten Wattestäbchen weg und bewegen Sie die Leber zur Kopfseite, um Magen und Darm vollständig freizulegen.
4. Der Magen und der Pylorus befinden sich unterhalb der Leber, und das Band von Treitz befindet sich am distalen Zwölffingerdarm. Doppelte Ligatur des Jejunums, 5 cm distal des Treitz-Bandes mit einer 6-0-Seidennaht (Abbildung 1A). Schneiden Sie das Jejunum in der Mitte der beiden Ligaturen und vernähen Sie den Jejunalstumpf mit einer 10-0-Seidennaht (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die mesenterialen Blutgefäße zu verdrehen.
5. Ziehen Sie den proximalen Jejunalschnitt 5 cm entlang des Darms bis zum Jejunum, um eine Jejunal-Jejunal-Anastomose zu erzeugen. Richten Sie die beiden Därme horizontal aus und verwenden Sie dann eine 10-0-Seidennaht, um die laterale Anastomose zu erzeugen (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Halten Sie den Darm während der Operation mit Kochsalzlösung feucht, um den Wasserverlust zu reduzieren. Dies verhindert, dass sich der Darm zusammenrollt, und erleichtert das Nähen.
6. Sichern Sie beide Enden des Darms und schneiden Sie den Schnitt auf die gleiche Länge (Abbildung 1D). Vernähen Sie die zweite Schicht der hinteren Darmwand mit einer durchgehenden Naht in voller Dicke.
   HINWEIS: Die Schnittlänge beträgt ca. 0,5-0,6 cm und der Nadelabstand ~0,5 mm.
7. Befestigen Sie beide Enden des Darms und nähen Sie die vordere Darmwand. Die erste Schicht der Vorderwand mit einer einfachen durchgehenden Naht und die zweite Schicht mit einer horizontalen Varusnaht vernähen (Abbildung 1E-F).
   HINWEIS: Tupfen Sie den Darminhalt mit Wattestäbchen ab, um eine Infektion der Bauchhöhle zu verhindern.
8. Ziehen Sie den distalen Jejunalschnitt 1 cm unterhalb des Pylorus in den Zwölffingerdarm, um eine Zwölffingerdarm-Jejunal-Anastomose zu erzeugen (Abbildung 1G). Vernähen Sie es mit der gleichen Methode wie in den Schritten 2.6-2.7 (Abbildung 1H-K).
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Naht an der Anastomosenecke, um Anastomosenleckagen zu reduzieren.
9. Ligustieren Sie den Darm mit der Mikrozange und schneiden Sie den Darm mit der Mikroschere. Ligatur des Zwölffingerdarms mit einer 6-0-Seidennaht, 2 mm vom distalen Ende der Zwölffingerdarm-Jejunalanastomose entfernt. Schneiden Sie mit einer Mikroschere in der Mitte und nähen Sie den Stumpf mit einer 10-0 Seidennaht (Abbildung 1L).
   HINWEIS: Die gastroduodenalen Gefäße verzweigen sich senkrecht zum Kopf der Bauchspeicheldrüse und grenzen an den Pylorus, was eine sorgfältige Untersuchung der Gefäße im Querschnitt erfordert. Der Zusammenfluss von Gallengang communis und Duodenum wurde lokalisiert, wobei darauf geachtet wurde, dass weder die Bauchspeicheldrüse noch der gemeinsame Gallengang beschädigt wurden.
10. Spülen Sie die Bauchhöhle mit 30 °C Kochsalzlösung aus. Führe den Darm wieder in die Bauchhöhle zurück. Nähen Sie den Muskel und die Haut separat mit einer 6-0 Seide. Desinfizieren Sie dann die Haut mit einem Jodophor.
11. Nach der Operation 30 °C Kochsalzlösung (30 ml/kg) subkutan in den Rücken injizieren, um eine Austrocknung zu verhindern. Injizieren Sie Penicillin (10 mg/kg) intramuskulär, um eine Infektion zu verhindern.

Abbildung 1: Duodenal-Jejunal-Bypass-Verfahren. (A) Lage des Jejunums 5 cm distal des Bandes von Treitz. (B) Ligatur des Jejunums mit 6-0 Seide verdoppeln und durch die Mitte der Ligatur schneiden. (C) Jejunal-Jejunal-Anastomose. (D) Machen Sie einen 0,5-0,6 cm langen Schnitt und nähen Sie die hintere Wand. (E-F) Vollständige Jejunal-Jejunal-Anastomose. (G) Ziehen Sie das distale Jejunal 1 cm unterhalb des Pylorus zum Zwölffingerdarm. (H) Duodenal-Jejunal-Anastomose. (I) Schneiden Sie die Zwölffingerdarm-Jejunal-Anastomose mit einem 0,5-0,6 cm langen Schnitt und vernähen Sie die hintere Wand mit einer einfachen durchgehenden Naht. (J-K) Vollständige Duodenal-Jejunal-Anastomose. (L) Bei 2 mm Abstand von der distalen zur Zwölffingerdarm-Jejunalanastomose den Zwölffingerdarm mit 6-0 Seide doppelt ligatisieren und die Mitte der Ligatur durchschneiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Allgemeine postoperative Betreuung

1. Legen Sie die Mäuse nach der Operation auf eine Heizdecke, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Lassen Sie die Mäuse frei kriechen, bis sie vollständig wach sind, bevor Sie in ihre Käfige zurückkehren.
2. Beschränken Sie am postoperativen Tag die Nahrungs- und Wassermenge und injizieren Sie 2 ml Kochsalzlösung subkutan in den Rücken der Mäuse. Geben Sie am ersten postoperativen Tag 10 ml 10% Glukose und ein funktionelles Getränk (Verhältnis 1:1) ohne Nahrung und injizieren Sie 1 ml Kochsalzlösung subkutan.
3. Füttern Sie die Mäuse am zweiten und dritten postoperativen Tag mit einer Mischung aus 20 ml 10% Glukose und einem funktionellen Getränk. Geben Sie den Mäusen nach dem vierten Tag reines Wasser und eine fettreiche Ernährung. Die Übergangsfütterung sollte entsprechend dem postoperativen Erholungsstatus in der folgenden Reihenfolge erfolgen: Lösung, halbflüssige oder feste Nahrung.
4. Postoperative Analgesie: Injizieren Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 12 Stunden von Tag 1 bis 3 und dann einmal täglich bis zum Tag 5.
5. Beobachten Sie nach der Operation die Fütterungsbedingungen, die Aktivität, den Kot und die Wundheilung der Mäuse.

Abbildung 2: Das Diagramm der DJB-Operation. (A) Duodenal-Jejunal-Anastomose. (B) Jejunal-Jejunal-Anastomose. (C) Biliopankreatische Gliedmaße. (D) Verdauungsglied. (E) Gemeinsame Gliedmaße. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Anatomie der DJB-Chirurgie. (A) Duodenal-Jejunal-Anastomose. (B) Jejunal-Jejunal-Anastomose. (C) Biliopankreatische Gliedmaße. (D) Verdauungsglied. (E) Gemeinsame Gliedmaße. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Postoperative Bewertung der metabolischen Parameter

1. Messung des Körpergewichts
   1. Fasten Sie die Mäuse 8 h vor der Messung. Wiegen Sie die Mäuse 8 Wochen lang wöchentlich am Montag vor und nach der Operation.
2. Messung der Nahrungsaufnahme
   1. Halten Sie eine Maus in jedem Käfig. Messen Sie die Menge an fester Nahrung in jedem Käfig vor und nach 24 Stunden. Die Differenz zwischen den beiden Werten stellt die tägliche Nahrungsaufnahme dar.
3. Stichprobenartige Blutzuckermessung
   1. Entnehmen Sie am wöchentlichen Montag der Messung um 8:00 Uhr einen Tropfen Blut von der Spitze des Mausschwanzes und geben Sie ihn auf einen Glukosestreifen, der in das Blutzuckermessgerät eingeführt wird.
4. Oraler Glukosetoleranztest
   1. Acht Wochen nach der DJB-Operation fasten Sie die Mäuse 8 Stunden lang, bevor Sie den oralen Glukosetoleranztest durchführen. Sammeln Sie einen Tropfen Blut von der Spitze des Mausschwanzes und legen Sie ihn auf einen Glukosestreifen, der in das Blutzuckermessgerät eingeführt wird. Verabreichen Sie eine orale Dosis von 20 % D-Glukose (2 g/kg). Messen Sie den Blutzuckerspiegel nach 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 Minuten nach der Sonde.

Ergebnisse

Rahmenbedingungen
Die mittlere Operationszeit für das DJB-Verfahren betrug 84,5 ± 2,6 Minuten. Fünfzehn Mäuse wurden einer DJB-Operation unterzogen, neun Mäuse überlebten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, ereigneten sich die meisten Todesfälle während der Operation oder in den folgenden 7 Tagen. Die Ursachen für den postoperativen Tod waren Blutungen (n=2) am postoperativen Tag 1, Anastomosenleckagen (n=1) am postoperativen Tag 4, Anastomosenobstruk...

Diskussion

Im Jahr 1953 führten Varco et ^al.18 den ersten jejuno-ilealen Bypass als Beginn der bariatrischen Chirurgie durch. Seitdem wurden zahlreiche bariatrische Operationen von Chirurgen durchgeführt. Diese Operationen haben zu Gewichtsverlust und verbesserten metabolischen Komplikationen geführt ^4,19,20. Darüber hinaus führten Mason und Ito²¹ 1967 d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abdominal retractor	F.S.T	17000-03	Colibri Retractor -3cm,retractor range 1.5cm/3cm long
1% sodium pentobarbital solution	Guangzhou Chemical Reagent Factory	/	Dissolved 500mg of pentobarbital sodium powder in 50ml of normal saline to obtain 1% pentobarbital sodium solution.
Benzylpenicillin sodium for Injection	North China Pharmaceutical Company Ltd.	F2062121	Penicillin
Buprenorphine	Guangzhou Chemical Reagent Factory	/	Analgesia
Buprenorphine	Guangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	/	Analgesic
Citric acid-sodium citrate buffer	LEAGENE	R00522	Buffer solution
Cotton buds	HaoZheng Medical	60220610	Cotton swabs
Depilatory paste	Veet	AAPR-S222	Hair removal cream
Ear tag	ZEYA	SUS304	Ear-mark
Electric blanket	ZOSEN	ZS-CWDRT	Heat pad
Electronic scale	WETTLER TOLEDO	20060902-6	Measure the weight
Enteral nutritional powder	Abbott Laboratories	/	Nutrition powder
Eye ointment	Guangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	/	Protect the eyes
Glucometer	Roche	6993788001	Assess blood glucose
Graphpad Prism version 9.4.1	GraphPad Software	version 9.4.1	Software for statistical analysis
High-fat diet (High Fat [60FDC] Purified Rodent Diet)	Dyets	112252	60kcal% High Fat Diet
Micro Forceps	Jinzhong Medical	18-1140	Micro forceps
Micro needle holder	Jinzhong Medical	EMT-160-Z	Needle holder
Micro Scissors	Jinzhong Medical	YBC010	Micro scissors
Microscope camera	LAPSUN	E 2000	Video
Ophthalmic scissors	Jinzhong Medical	Y00030	Surgical scissors
Pentobarbital	Guangzhou Chemical Reagent Factory	/	Narcosis
Sodium chloride Injection	Guangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	B21L0301	NaCl 0.9%
Stereo microscope	ZEISS	Stemi 305	Binocular stereomicroscope
Streptozotocin	Sigma	S110910-1g	STZ
Suture line	LINGQIAO SUTURE	ZS-LQPMRZ5/0	Prolene 6/0,Prolene 10/0
Tissue forceps	Jinzhong Medical	H1701	Surgical forceps