다이어트 유발 비만 당뇨병 마우스의 십이지장-제주날 우회 수술

요약

십이지장 우회술(DJB) 수술은 포도당 대사를 개선하고 인슐린 저항성을 줄일 수 있습니다. 여기에서는 DJB의 안정적이고 신뢰할 수 있는 마우스 모델을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

비만과 제2형 당뇨병의 유병률은 전 세계적으로 심각한 건강 문제입니다. 비만은 제2형 당뇨병, 심혈관 질환 및 일부 암의 주요 병원성 요인입니다. 비만 수술은 비만과 당뇨병 모두에 대한 장기적이고 효과적인 치료 옵션을 제공합니다. 위소매절제술(SG)과 루엥와이(Roux-en-Y) 위우회술(RYGB)은 가장 인기 있는 비만 수술로 널리 알려져 있습니다. 또한 여러 탐색적 비만 수술에서 유망한 치료 효과가 입증되었습니다. 체질량 지수가 낮은 당뇨병 환자를 위해 특별히 고안된 십이지장-제주날 우회술(DJB)은 유익한 대사 결과를 보여주었습니다. 그러나 체중과 무관한 대사 이점은 제한된 동물 모델로 인해 완전히 이해되지 않았습니다. 이 기사에서는 식이 유도 비만(DIO) 당뇨병 마우스에서 DJB 수술을 수행하기 위한 최적화된 치료 프로토콜과 수술 기술에 대해 설명합니다. 마우스 모델을 사용하면 DJB 수술로 인한 변화의 특성을 더 잘 이해하는 동시에 관련 임상 실습을 용이하게 할 수 있습니다.

서문

비만과 제2형 당뇨병은 세계에서 가장 흔한 만성 질환이며, 젊은 사람들 사이에서 유병률이 증가하고 있습니다¹. 비만 수술은 비만과 당뇨병에 대한 가장 효과적인 치료법으로, 장기적인 혈당 안정성을 촉진하는 동시에 비만과 관련된 합병증을 개선합니다 ^2,3. 비만 수술에는 여러 유형이 있으며, 위 용적 또는 장 흡수를 감소시키는지 여부에 따라 분류됩니다. 여기에는 제한, 흡수 장애 및 조합 ^4,5가 포함됩니다.

십이지장 우회술(DJB)은 루비노(Rubino)와 마레스코(Marescaux)에 의해 처음 개발되었으며, 이들은 제2형 당뇨병이 위 부피를 줄이는 것보다 십이지장과 제주눔을 연결하여 완화될 수 있음을 보여주었습니다 ^6,7. DJB는 위 전체를 보존하고 전체 십이지장과 근위 jejunum을 우회합니다. 장은 담췌장(biliopancreatic), 소화기(digestive), 일반지(general limb)로 나뉜다(general limbs) ^6,8. DJB는 Roux-en-Y 위 우회술(RYGB), 미니 위 우회술, 담췌장 우회술, 십이지장 전환술, DJB 플러스 위소매절제술⁹ 등 비만 수술과 몇 가지 유사점을 공유합니다. RYGB에 비해 DJB는 위장관 문합이 필요하지 않아 수술 시간이 단축되고 시술 성공률이 향상됩니다. DJB는 포도당 대사를 개선하는 데 있어 RYGB와 유사하지만 체중에는 영향을 미치지 않는다¹⁰. DJB 수술 후 원위 소장으로의 빠른 음식 전달은 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)의 분비를 자극하여 포도당 대사를 개선합니다^11,12.

동물 모델의 사용은 대사, 세포 및 분자 경로를 이해하는 데 필수적입니다. 비만 수술의 동물 모델은 비만과 당뇨병의 기저에 있는 잠재적 메커니즘을 이해하는 데 기여했습니다^13,14. 그러나 종 간의 생리학적 차이로 인해 동물 모델에서 인간의 질병을 완벽하게 복제하는 것은 불가능하다¹⁵. 연구 목적으로 이용 가능한 다양한 동물 모델 중에서, 다이어트 유발 비만(DIO) 마우스 모델은 인간의 비만 및 대사 증후군과 가장 유사하다¹⁶. 수술의 타당성을 결정하고 추가 연구를 위한 기술을 제공하기 위해 DJB 수술을 위해 마우스를 선택했습니다. 이 원고는 DJB 수술의 기술적 측면과 실험적 세부 사항에 대한 포괄적인 요약을 제공합니다.

프로토콜

아래에 설명된 모든 프로토콜 단계는 승인 번호 2020112501에 따라 남부 극장 사령부 종합병원 동물 보호 및 사용 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 일반적인 수술 전 준비

참고: 6주 된 수컷 C57BL/6 마우스 30마리를 구입했습니다. 마우스는 12시간의 밝음/어두운 주기에 따라 SPF(Specific Pathogen-Free) 실험실에 수용되었습니다. 온도, 22 ± 2 °C; 그리고 습도, 55-65%. 생쥐에게 물을 무료로 제공하고 6주 동안 60% kcal의 지방 식단을 먹이어 비만을 유도했습니다. 당뇨병을 유발하기 위해 40mg/kg의 스트렙토조토신을 복강내 주사하여 5일 동안 투여하였다¹⁷. 30 마리의 마우스 중 22 마리의 마우스는 300 mg / dL> 무작위 혈당을 선별하고 DJB (n = 15) 및 가짜 수술 (n = 7) 그룹에 무작위로 할당했습니다. 8마리의 쥐는 표준 이하의 혈당으로 인해 실험에서 제외되었습니다.

1. 수술 전에 8시간 동안 쥐를 단식시킵니다. 수술 2시간 전에 물을 빼내십시오.
2. 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액(6mL/kg)과 부프레노르핀(1mg/kg)을 복강 내로 투여합니다. 집게로 쥐의 발가락이나 꼬리를 만지고 쥐가 뚜렷한 경련이나 떨림을 보이지 않는지 확인하십시오. 적절한 마취 하에 쥐는 산소 보충 없이 자유롭게 숨을 쉴 수 있습니다.
3. 생쥐를 멸균판의 누운 자세에 놓고 실체현미경 아래에 놓습니다. 눈에 눈 연고를 바릅니다. 전기 담요를 사용하여 절차 내내 쥐를 따뜻하게 유지하십시오. 수술 가운, 멸균 장갑 및 고압멸균 기구를 포함한 멸균 절차를 사용하십시오.
4. 가짜 대조군 마우스의 경우 유문 아래 1cm의 십이지장과 Treitz 아래 5cm의 제주눔에 각각 두 개의 절개를 한 다음 절개 부위를 봉합합니다.

2. 십이지장 jejunal bypass: 수술 절차

1. 시포이드의 제모 페이스트를 복부에 바르면 이 부위의 털을 제거합니다. 크림을 닦아내고 피부가 깨끗한지 확인하십시오. 요오드와 알코올 용액을 번갈아 가며 문질러 해당 부위를 세 번 문지릅니다.
2. 멸균 드레이프로 마우스를 덮고 수술 부위가 노출된 상태로 두고 시포이드에서 복부까지 2cm를 절개합니다.
3. 복부 견인기를 사용하여 복강을 노출시킵니다. 젖은 면봉으로 복부 지방을 밀어내고 간을 두부 쪽으로 이동시켜 위와 장이 충분히 노출되도록 합니다.
4. 위와 유문은 간 아래에 있으며 Treitz의 인대는 원위 십이지장에 있습니다. Treitz 인대에서 5cm 원위인 jejunum을 6-0 실크 봉합사로 이중 결찰합니다(그림 1A). 두 결찰의 중간 지점에서 jejunum을 자르고 10-0 실크 봉합사로 jejunal 그루터기를 봉합합니다(그림 1B).
   참고: 장간막 혈관을 꼬지 마십시오.
5. 근위 jejunal 절개 부위를 장을 따라 jejunum까지 5cm 당겨 jejunal-jejunal 문합을 만듭니다. 두 장을 수평으로 정렬한 다음 10-0 실크 봉합사를 사용하여 측면 문합을 만듭니다(그림 1C).
   참고: 수술 중에는 수분 손실을 줄이기 위해 장을 식염수로 촉촉하게 유지하십시오. 이렇게 하면 장이 말리는 것을 방지하고 봉합을 더 쉽게 할 수 있습니다.
6. 장의 양쪽 끝을 고정하고 절개 부위를 동일한 길이로 자릅니다(그림 1D). 후장 벽의 두 번째 층을 전체 두께의 연속 봉합사로 봉합합니다.
   알림: 절개 길이는 약 0.5-0.6cm이고 바늘 거리는 ~0.5mm입니다.
7. 장의 양쪽 끝을 고정하고 장의 전벽을 봉합합니다. 전벽의 첫 번째 층을 간단한 연속 봉합사로 봉합하고 두 번째 층을 수평 내반 봉합사로 봉합합니다(그림 1E-F).
   알림: 복강의 감염을 방지하기 위해 면봉으로 장 내용물을 면봉으로 닦습니다.
8. 유문 아래 1cm 아래의 십이지장으로 원위 jejunal 절개 부위를 당겨 십이지장-jejunal 문합을 만듭니다(그림 1G). 2.6-2.7 단계와 동일한 방법을 사용하여 봉합합니다 (그림 1H-K).
   알림: 문합부 누출을 줄이기 위해 문합부 모서리의 봉합사를 확인하십시오.
9. 마이크로 집게로 장을 결찰하고 마이크로 가위로 장을 자릅니다. 십이지장-제주날 문합체의 말단 끝에서 2mm 떨어진 6-0 실크 봉합사로 십이지장을 이중 결찰합니다. 마이크로 가위로 중간 지점을 자르고 10-0 실크 봉합사로 그루터기를 봉합합니다(그림 1L).
   참고: 위십이지장 혈관은 췌장 머리에 수직으로 분기되고 유문에 인접해 있어 횡면의 혈관을 주의 깊게 탐색해야 합니다. 총담관과 십이지장이 합류하는 지점에 위치하여 췌장이나 총담관을 손상시키지 않도록 주의했습니다.
10. 30°C 식염수로 복강을 헹굽니다. 장을 복강으로 되돌려 놓습니다. 6-0 실크로 근육과 피부를 따로 봉합합니다. 그런 다음 iodophor로 피부를 소독하십시오.
11. 수술 후에는 탈수를 방지하기 위해 30°C의 식염수(30mL/kg)를 뒤쪽에 피하로 주입합니다. 감염을 예방하기 위해 페니실린(10mg/kg)을 근육 주사합니다.

그림 1: 십이지장-제정 우회 절차. (A) Treitz 인대에서 5cm 떨어진 jejunum의 위치. (B) 6-0 실크로 jejunum을 이중으로 결찰하고 합자의 중앙을 자릅니다. (C) Jejunal-jejunal 문합술. (D) 0.5-0.6cm를 절개하고 후벽을 봉합합니다. (E-F) 완전한 Jejunal-jejunal 문합. (G) 유문에서 1cm 아래 십이지장까지 원위 jejunal을 당깁니다. (H) 십이지장-제정골 문합. (I) 0.5-0.6cm 절개로 십이지장-제정골 문합을 절단하고 간단한 연속 봉합사로 후벽을 봉합합니다. (제이케이) 완전한 십이지장-제정골 문합술. (L) 원위부에서 십이지장-제주날 문합까지 2mm에서 십이지장을 6-0 실크로 이중 결찰하고 인자의 중앙을 절단합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 일반적인 수술 후 관리

1. 수술 후에는 저체온증을 방지하기 위해 생쥐를 전기 담요 위에 올려 놓습니다. 쥐가 완전히 깨어날 때까지 자유롭게 기어 다니다가 케이지로 돌아가도록 하십시오.
2. 수술 후 날에는 음식과 물을 제한하고 생쥐 뒤쪽에 식염수 2mL를 피하로 주사합니다. 수술 후 첫 날에는 10% 포도당 10mL와 기능성 음료(1:1 비율)를 음식 없이 투여하고 식염수 1mL를 피하로 주사합니다.
3. 수술 후 두 번째 및 세 번째 날에는 10% 포도당 20mL와 기능성 음료를 혼합하여 쥐에게 먹입니다. 4일째 되는 날에는 생쥐에게 순수한 물과 고지방 식단을 먹이십시오. 과도기 수유는 수술 후 회복 상태에 따라 용액, 반액체 또는 고체 음식의 순서로 수행해야 합니다.
4. 수술 후 진통제: 1일째부터 3일까지 12시간마다 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 주사한 후 5일째까지 하루에 한 번 주사합니다.
5. 수술 후 쥐의 섭식 상태, 활동, 대변 및 상처 치유를 관찰하십시오.

그림 2: DJB 수술 다이어그램. (A) 십이지장-정장 문합술. (B) Jejunal-jejunal 문합. (C) 담췌장사지. (D) 소화사지. (E) 일반 사지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: DJB 수술의 해부학. (A) 십이지장-제주날 문합. (B) Jejunal-jejunal 문합. (C) 담췌장사지. (D) 소화사지. (E) 일반 사지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 수술 후 대사 매개변수 평가

1. 체중 측정
   1. 측정하기 전에 8시간 동안 마우스를 빠르게 만듭니다. 8주 동안 매주 수술 전후 월요일에 쥐의 무게를 잰다.
2. 음식 섭취량 측정
   1. 각 케이지에 한 마리의 쥐를 수용합니다. 24시간 전후에 각 케이지에 있는 고형 식품의 양을 측정합니다. 두 값의 차이는 일일 음식 섭취량을 나타냅니다.
3. 무작위 혈당 측정
   1. 측정하는 매주 월요일 오전 8:00에 쥐 꼬리 끝에서 혈액 한 방울을 채취하여 혈당계에 삽입된 포도당 스트립에 적용합니다.
4. 경구 포도당 내성 검사
   1. DJB 수술 8주 후, 경구 포도당 내성 테스트 전에 8시간 동안 마우스를 단식시킵니다. 쥐 꼬리 끝에서 혈액 한 방울을 채취하여 혈당계에 삽입된 포도당 스트립에 놓습니다. 20% D-포도당(2g/kg)을 경구 투여합니다. 혈당 측정 후 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 및 180 분에서 혈당 수치를 측정합니다.

결과

일반 조건
DJB 시술의 평균 수술 시간은 84.5분± 2.6분이었다. 15마리의 생쥐가 DJB 수술을 받았고, 9마리의 생쥐가 생존했다. 표 1에서 보는 바와 같이 대부분의 사망은 수술 중 또는 수술 후 7일 이내에 발생했다. 수술 후 사망 원인은 수술 후 1일째 출혈(n=2), 수술 후 4일째 문합 누출(n=1), 수술 후 7일째 문합 폐색(n=2), 수술 3주 후 원인 불명(n=1)이었?...

토론

1953년, Varco et ^al.18은 비만 수술의 시작으로 최초의 jejuno-ileal bypass 시행을 시행했습니다. 그 이후로 외과 의사들은 수많은 비만 수술을 수행했습니다. 이러한 수술은 체중 감소와 대사 합병증 개선으로 이어졌습니다 ^4,19,20. 또한 1967년 Mason과^{Ito 21}은 체중을 효과적으?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abdominal retractor	F.S.T	17000-03	Colibri Retractor -3cm,retractor range 1.5cm/3cm long
1% sodium pentobarbital solution	Guangzhou Chemical Reagent Factory	/	Dissolved 500mg of pentobarbital sodium powder in 50ml of normal saline to obtain 1% pentobarbital sodium solution.
Benzylpenicillin sodium for Injection	North China Pharmaceutical Company Ltd.	F2062121	Penicillin
Buprenorphine	Guangzhou Chemical Reagent Factory	/	Analgesia
Buprenorphine	Guangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	/	Analgesic
Citric acid-sodium citrate buffer	LEAGENE	R00522	Buffer solution
Cotton buds	HaoZheng Medical	60220610	Cotton swabs
Depilatory paste	Veet	AAPR-S222	Hair removal cream
Ear tag	ZEYA	SUS304	Ear-mark
Electric blanket	ZOSEN	ZS-CWDRT	Heat pad
Electronic scale	WETTLER TOLEDO	20060902-6	Measure the weight
Enteral nutritional powder	Abbott Laboratories	/	Nutrition powder
Eye ointment	Guangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	/	Protect the eyes
Glucometer	Roche	6993788001	Assess blood glucose
Graphpad Prism version 9.4.1	GraphPad Software	version 9.4.1	Software for statistical analysis
High-fat diet (High Fat [60FDC] Purified Rodent Diet)	Dyets	112252	60kcal% High Fat Diet
Micro Forceps	Jinzhong Medical	18-1140	Micro forceps
Micro needle holder	Jinzhong Medical	EMT-160-Z	Needle holder
Micro Scissors	Jinzhong Medical	YBC010	Micro scissors
Microscope camera	LAPSUN	E 2000	Video
Ophthalmic scissors	Jinzhong Medical	Y00030	Surgical scissors
Pentobarbital	Guangzhou Chemical Reagent Factory	/	Narcosis
Sodium chloride Injection	Guangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	B21L0301	NaCl 0.9%
Stereo microscope	ZEISS	Stemi 305	Binocular stereomicroscope
Streptozotocin	Sigma	S110910-1g	STZ
Suture line	LINGQIAO SUTURE	ZS-LQPMRZ5/0	Prolene 6/0,Prolene 10/0
Tissue forceps	Jinzhong Medical	H1701	Surgical forceps