Verbesserung der Dichtekarten durch Entfernen der Mehrheit der Partikel in den finalen Stacks der kryogenen Elektronenmikroskopie mit Einzelpartikeln

Zusammenfassung

Eine fortschrittliche Partikelauswahlmethode für Kryo-EM, nämlich CryoSieve, verbessert die Auflösung der Dichtekarte, indem sie einen Großteil der Partikel in den endgültigen Stapeln entfernt, wie ihre Anwendung auf einem realen Datensatz zeigt.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren haben technologische und methodische Fortschritte auf dem Gebiet der kryogenen Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und der Einzelteilchenanalyse (SPA) unsere Fähigkeit zur hochauflösenden Strukturuntersuchung biologischer Makromoleküle erheblich verbessert. Dieser Fortschritt hat eine neue Ära molekularer Erkenntnisse eingeläutet, die die Röntgenkristallographie als dominierende Methode abgelöst und Antworten auf langjährige Fragen in der Biologie gegeben hat. Da die Kryo-EM nicht von der Kristallisation abhängt, die eine wesentliche Einschränkung der Röntgenkristallographie darstellt, werden Partikel unterschiedlicher Qualität eingefangen. Daher ist die Auswahl der Partikel entscheidend, da die Qualität der ausgewählten Partikel die Auflösung der rekonstruierten Dichtekarte direkt beeinflusst. Ein innovativer iterativer Ansatz für die Partikelauswahl, genannt CryoSieve, verbessert die Qualität der rekonstruierten Dichtekarten erheblich, indem er die Anzahl der Partikel im endgültigen Stapel effektiv reduziert. Experimentelle Beweise zeigen, dass diese Methode die Mehrheit der Partikel in den endgültigen Stapeln eliminieren kann, was zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Qualität der Dichtekarten führt. In diesem Artikel wird der detaillierte Workflow dieses Ansatzes beschrieben und seine Anwendung auf ein reales Dataset vorgestellt.

Einleitung

Kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Die Einzelpartikelanalyse (SPA) hat sich zu einer dominierenden Methode zur Bestimmung hochauflösender dreidimensionaler Dichtekarten biologischer Makromoleküle entwickelt. Aufgrund einer Reihe von technologischen Innovationen 1,2,3,4,5,6, genannt Auflösungsrevolution 7, ist die Kryo-EM in der Lage, die Strukturen biologischer Makromoleküle mit bis zu atomarer Auflösung in einer noch nie dagewesenen Geschwindigkeit zu bestimmen. Dieser Durchbruch markiert den Beginn einer neuen Ära molekularer Erkenntnisse, die die Röntgenkristallographie als vorherrschende Technik ablöste und langjährige biologische Fragen beantwortete.

Die Kryo-EM SPA unterscheidet sich von der Röntgenkristallographie, da sie keine Kristallisation biologischer Makromoleküle erfordert. Stattdessen wird eine Lösung, die die biologischen Zielmakromoleküle enthält, schnell in glasartigem Eis eingefroren. Es wird dann mit einem Elektronenstrahl abgebildet, um eine Reihe von Mikroskopaufnahmen zu erstellen, wobei die Notwendigkeit einer Kristallisation^{umgeht 8}. Anschließend werden Particle-Picking-Algorithmen verwendet, um einzelne Rohpartikel aus diesen Mikroaufnahmen zu extrahieren 4,9,10,11,12. Da die Kryo-EM nicht von der Kristallisation abhängt, ist es natürlich, dass extrahierte Partikel überwiegend beschädigt sind oder sich in unerwünschten Konformationszuständen befinden, was mehrere Partikelauswahlrunden erforderlich macht, um eine hochauflösende Dichtekarte zu erhalten. In der Kryo-EM-SPA-Bildverarbeitung ist die Partikelselektion daher entscheidend für die Erstellung hochauflösender Dichtekarten¹³.

Zu den Standardmethoden der Partikelauswahl bei der Kryo-EM gehören die zweidimensionale (2D) und die dreidimensionale (3D) Klassifizierung¹⁴. Die 2D-Klassifizierung kategorisiert Partikel in eine vordefinierte Anzahl von Gruppen, was zu einem durchschnittlichen Bild und einer geschätzten 2D-Auflösung für jede Klasse führt. Forscher können diese Klassen dann visuell inspizieren und Partikel aus Gruppen mit niedrigerer Auflösung entfernen, um die verbleibenden in Rekonstruktionen zu verwenden, um eine höhere Auflösung zu erreichen. Sobald die Partikelposen mithilfe von Verfeinerungsalgorithmen festgelegt sind, fahren die Forscher mit der 3D-Klassifizierung fort und gruppieren die Partikel in mehrere Klassen. Dies ermöglicht eine visuelle Inspektion der rekonstruierten Dichtekarte für jede Klasse, wodurch unerwünschte Partikel, wie z. B. solche aus unerwünschten Konformationen, ausgeschlossen werden können. Nach mehreren Klassifizierungsrunden wird ein endgültiger Stapel erhalten, der aus relativ hochwertigen Partikeln besteht. Diese finalen Stacks sind maßgeblich an der Erstellung von Dichtekarten mit atomarer oder nahezu atomarer Auflösung beteiligt.

Zhu und ihre Kollegen haben gezeigt, dass auf diesen finalen Stacks¹⁵ eine weitere Partikelselektion durchgeführt werden kann. CryoSieve¹⁵, eine innovative iterative Methode zur Partikelselektion, kann eingesetzt werden, um die Qualität der endgültigen Dichtekarte zu verbessern, indem die Anzahl der Partikel erheblich reduziert wird. Während andere Kriterien und Software für die Partikelsortierung, wie z. B. die normierte Kreuzkorrelationsmethode (NCC)¹⁶, der Angular Graph Consistency (AGC)-Ansatz¹⁷ und die Non-Alignment-Klassifizierung⁵, derzeit in diesem Bereich verwendet werden, hat sich gezeigt, dass diese Methode diese Algorithmen in Bezug auf die Wirksamkeit übertrifft.

In dieser Studie stellen wir Ihnen einen detaillierten Leitfaden für den gesamten Prozess vor. Als Fallstudie haben wir diese neue Methode auf den Datensatz des Influenza-Hämagglutinin-Trimers (EMPIAR-Eintrag: 10097)¹⁸ angewendet, der 130.000 Partikel in seinem endgültigen Stapel enthält. Unser Verfahren verwarf erfolgreich etwa 73,8% der Partikel aus dem letzten Stapel dieses Datensatzes, wodurch die Auflösung der rekonstruierten Dichtekarte von 4,11 Å auf 3,62 Å verbessert wurde. Zusätzlich zum Influenza-Hämagglutinin-Trimer werden in der früheren Veröffentlichung¹⁵ Ergebnisse aus mehreren Datensätzen vorgestellt, die eine Vielzahl von Auflösungen und Molekulargewichten von Biomolekülen zeigen.

Protokoll

1. Einbau

1. Überprüfen und Konfigurieren der GPU-Beschleunigungsumgebung
   1. Öffnen Sie das Terminal und geben Sie den Befehl nvidia-smi ein. Stellen Sie sicher, dass der Befehl erfolgreich alle Informationen zu den GPU-Karten anzeigt und die CUDA-Version höher als 10.2 ist. Führen Sie den Befehl conda -V aus, um zu überprüfen, ob Conda installiert ist (Ergänzende Abbildung 1).
2. Konfigurieren der virtuellen Umgebung
   1. Geben Sie den folgenden Befehl ein, um die virtuelle Umgebung einzurichten, und ersetzen Sie CRYOSIEVE_ENV durch den gewünschten Umgebungsnamen: conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge. Warten Sie einige Minuten, bis die Umgebung erfolgreich konfiguriert ist (ergänzende Abbildung 2).
      HINWEIS: Benutzer haben die Flexibilität, den Umgebungsnamen nach Bedarf zu ändern. Der bereitgestellte Befehl ist spezifisch für CUDA 10.2. Wenn eine andere CUDA-Version gewünscht wird, passen Sie die Versionsnummer für cudatoolkit an.
3. Installieren Sie CryoSieve
   1. Aktivieren Sie die Umgebung, indem Sie den Befehl conda activate CRYOSIEVE_ENV ausführen. Installieren Sie die Software, indem Sie pip install cryosieve oder conda install -c mxhulab cryosieve ausführen (Ergänzende Abbildung 3). Geben Sie cryosieve -h ein und stellen Sie sicher, dass die Hilfeinformationen korrekt angezeigt werden (Ergänzende Abbildung 4).

2. Partikel-Siebung

1. Abrufen der Daten
   1. Laden Sie den EMPIAR-10097 final stack Datensatz von EMPIAR herunter (siehe Materialtabelle). Laden Sie die Sterndatei, die Maskendatei (mask.mrc) und das ursprüngliche Modell (für den Schritt der Neuschätzung; initial.mrc) von Github herunter (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie alle diese Dateien zusammen in einem Ordner (Ergänzende Abbildung 5).
      HINWEIS: Das Repository in https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos verwendet Git Large File Storage (Git LFS). Die Installation von Git LFS ist für das Klonen des gesamten Repositorys unerlässlich. Alternativ können Sie über den GitHub-Link auf die Datei zugreifen und auf die Schaltfläche Rohdatei herunterladen klicken, um eine einzelne Datei herunterzuladen.
2. Prozess-Partikelsiebung
   1. Öffnen Sie das Terminal und verwenden Sie den Befehl: cd FILEPATH, um zu dem Ordner zu navigieren, in dem sich das Dataset befindet. Aktivieren Sie die Conda-Umgebung durch: conda activate CRYOSIEVE_ENV.
   2. Geben Sie den folgenden Befehl ein, um unser Teilchensiebexperiment zu starten: cryosieve --reconstruct_software relion_reconstruct --postprocess_software relion_postprocess --i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star --o output/ --mask mask.mrc --angpix 1.3099979 --num_iters 10 --frequency_start 40 --frequency_end 3 --retention_ratio 0.8 --sym C3 --num_gpus 1 --balance (Ergänzende Abbildung 5). Während der Ausführung zeigt das Terminal die Ausgabeprotokolle für jede Iteration an.
      HINWEIS: Detaillierte Anweisungen für jede Option finden Sie in der Zusatzdatei 1. Die Bearbeitungszeit und die Mindestanforderungen für die Ausführung sind in der Zusatzdatei 2 aufgeführt. T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star wurde von CryoSPARC von T40_HA_130K-Equalized_run-data.star (heruntergeladen von EMPIAR) verfeinert, um die Auswirkungen zu mildern, die durch Fortschritte bei der Orientierungsschätzung verursacht wurden.

3. Die optimale Iteration finden

1. Überprüfen der Auflösungen
   1. Verwenden Sie den Befehl: grep "+ FINAL RESOLUTION:" output/_postprocess*.txt, um die Auflösungsergebnisse für die 10 Iterationen der Siebung zu drucken (Abbildung 1). Da der in der 7^. Iteration gefilterte Partikelstapel die höchste Auflösung mit den wenigsten Partikeln aufweist, ist es wahrscheinlich, dass er das optimale Ergebnis liefert.
      HINWEIS: Um eine unbeabsichtigte Informationsübertragung von verworfenen zu zurückgehaltenen Partikeln¹⁵ zu vermeiden und sicherzustellen, dass der Partikelstapel nach der 7. Iteration tatsächlich optimal ist, müssen Benutzer einen Neuschätzungsschritt für benachbarte Iterationen ausführen. In diesem Protokoll werden die Iterationen 4, 5, 6, 7 und 8 einer Verifizierung unterzogen.
2. Importiert gesiebte Partikel
   1. Öffnen Sie die CryoSPARC-Weboberfläche und gehen Sie folgendermaßen vor: Betreten Sie einen Arbeitsbereich und klicken Sie auf die Schaltfläche Builder oben rechts im Panel. Wählen Sie im Bedienfeld die Option Partikelstapel importieren aus und klicken Sie darauf. Geben Sie im Abschnitt "Parameter" des Bedienfelds "Partikelstapelimport" den Partikelmetapfad als _iter{n}.star-Datei an, die sich im Ausgabeordner der abgeschlossenen Ergebnisse befindet, sowie den Partikeldatenpfad zu dem Ordner, in dem die MRCS-Datei gespeichert ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Auftrag in die Warteschlange" und dann auf die Schaltfläche "Warteschlange", um den Vorgang zu starten. Verwenden Sie die gleiche Methode, um die verbleibenden Iterationen zu importieren, die neu geschätzt werden müssen (Ergänzende Abbildung 6A).
3. Importieren des ursprünglichen Modells
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Builder oben rechts im Panel. Wählen Sie im Bedienfeld die Option 3D-Volumen importieren aus und klicken Sie darauf.
   2. Geben Sie den Datenpfad des Volumes als Datei initial.mrc an. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Job in die Warteschlange" und dann auf die Schaltfläche "Warteschlange", um den Vorgang zu starten (Ergänzende Abbildung 6B).
      HINWEIS: Das ursprüngliche Modell kann auch durch Ab-initio-Rekonstruktion generiert werden (Ergänzungsdatei 3).
4. Homogene Verfeinerung (Bauauftrag)
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Builder oben rechts im Panel. Wählen Sie im Bedienfeld die Option Homogene Verfeinerung aus und klicken Sie darauf.
      HINWEIS: Eine ungleichmäßige Verfeinerung ist ebenfalls möglich.
5. Homogene Veredelung (Import von Partikeln)
   1. Öffnen Sie im Hauptfenster auf der linken Seite den Auftrag zum Importieren des Partikelstapels der 5^. Iteration (oder der gewünschten Iteration). Ziehen Sie das importierte Partikelmodul von der rechten Seite des Hauptfensters und legen Sie es im Abschnitt "Partikelstapel" des Builders auf der rechten Seite ab. Schließen Sie den Auftrag "Partikelstapel importieren", indem Sie auf das rote X in der oberen rechten Ecke des Hauptfensters klicken.
   2. Öffnen Sie den Auftrag zum Importieren von 3D-Volumen. Ziehen Sie das importierte Volumes-Modul von der rechten Seite des Hauptfensters und legen Sie es im Abschnitt "Initial volume" des Builders auf der rechten Seite ab.
6. Homogene Verfeinerung (Ändern Sie die Parameter)
   1. Suchen Sie unter der Parameterfalte die Option Symmetrie, und legen Sie sie auf C3 fest. Suchen Sie die Option Erneutes Wiederholen der GS-Teilung erzwingen und deaktivieren Sie sie. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Auftrag in die Warteschlange" und dann auf die Schaltfläche "Warteschlange", um die homogene Verfeinerung zu starten. Führen Sie die homogene Verfeinerung für die verbleibenden Iterationen mit derselben Methode durch (Ergänzende Abbildung 6C-D).
      HINWEIS: Die Option Wiederholung des GS-Splits erzwingen ist entscheidend. Das Deaktivieren dieser Option stellt sicher, dass CryoSPARC die Goldstandard-Aufteilung beibehält, die durch die Sterndatei gegeben ist, wodurch eine Überanpassung vermieden wird. Eine detaillierte Begründung für die Deaktivierung von Force Re-do GS Split finden Sie in der Zusatzdatei 4.
7. Warten Sie, bis alle Aufträge ausgeführt wurden, um die Ergebnisse zu erhalten. Basierend auf den Ergebnissen wird bestätigt, dass der in der 6^. Iteration gefilterte Partikelstapel das tatsächlich optimale Ergebnis ist.
   HINWEIS: Es ist normal, dass die erzielten Ergebnisse geringfügige zufällige Abweichungen von den in diesem Protokoll angegebenen Ergebnissen aufweisen. Diese Abweichungen haben keinen Einfluss auf die Gesamtschlussfolgerung.

Diskussion

Die Kryo-EM gilt als zentrale Technik zur Aufklärung der Strukturen biologischer Moleküle. In diesem Prozess ist nach der Datenerfassung mittels Mikroskopie die Extraktion von Partikeln aus Mikroskopbildern unerlässlich, gefolgt von deren Klassifizierung in mehreren Schritten, um den endgültigen Stapel zusammenzustellen. Eine häufige Herausforderung ist das Vorherrschen von beschädigten oder unerwünscht konformen Partikeln, was die Notwendigkeit einer wiederholten Partikelauswahl unterstreicht, um hochauflösende Dichtekarten zu erhalten. Dies macht die Partikelauswahl zu einem entscheidenden Schritt in der Kryo-EM-SPA, um qualitativ hochwertige Dichtekarten zu erhalten. Zu den bestehenden Partikelauswahltechniken gehören der statistische Nicht-Kipp-Validierungsalgorithmus²², der auf Z-Scores^{basierende Ansatz 23} und das Verfahren zur Schätzung der Winkelgenauigkeit²⁴.

CryoSieve erweist sich in diesem Zusammenhang als wertvolles Werkzeug, das in der Lage ist, eine beträchtliche Anzahl von Fremdpartikeln aus dem endgültigen Stapel zu eliminieren. Diese Reduzierung erhöht nicht nur die Recheneffizienz der Rekonstruktion, sondern rationalisiert auch den Prozess. Es bietet eine umfassende Suite für die Partikelauswahl, bei der das Ausmaß des Partikelverwurfs und die daraus resultierende Verbesserung der Auflösung weitgehend von der anfänglichen Datenqualität und den bei der Datenverarbeitung verwendeten Methoden abhängen.

In diesem Manuskript haben wir einen vollständigen Arbeitsablauf der Partikelsiebung unter Verwendung des realen Falldatensatzes von Influenza-Hämagglutinin-Trimer vorgestellt (EMPIAR-Eintrag: 10097). Die hier behandelten und diskutierten Schritte können als Partikelsiebung und Neuschätzung der Pose zusammengefasst werden. Das endgültige 3D-rekonstruierte Volumen erreichte eine Auflösung von 3,62 Å, und die Seitenketten in Alpha-Helices waren im nachbearbeiteten Volumen im Vergleich zur veröffentlichten Dichtekarte klarer.

CryoSieve ist eine Open-Source-Methode, die auf GitHub (https://github.com/mxhulab/cryosieve) verfügbar ist. Ein ausführliches Tutorial finden Sie auch auf der Homepage. Benutzer können es installieren und verwenden, indem sie dem Tutorial folgen. Zusätzlich werden zwei Module, cryosieve-csrefine und cryosieve-csrhbfactor, bereitgestellt. Das Modul cryosieve-csrefine wurde speziell entwickelt, um die sequentielle Ausführung verschiedener Vorgänge innerhalb von CryoSPARC zu automatisieren (Ergänzende Datei 5). Zu diesen Vorgängen gehören das Importieren von Partikelstapeln und das Ausführen von Ab-initio-, homogenen oder ungleichmäßigen Verfeinerungsaufträgen. Auf der anderen Seite wurde das Kryosieve-csrhbfactor-Modul entwickelt, um die Bestimmung des Rosenthal-Henderson-B-Faktors zu automatisieren, indem es die Fähigkeiten von cryosieve-csrefine nutzt (Supplementary File 6).

Derzeit ist die Anwendung dieser Methode auf einzelne Konformationsszenarien beschränkt. Folglich sind in Fällen, in denen Partikel mehrere Konformationen darstellen, ihre Fähigkeiten eingeschränkt. Anwendern wird empfohlen, zunächst eine 3D-Klassifizierung durchzuführen, um Partikel unterschiedlicher Konformationen zu trennen, bevor sie sie für eine verfeinerte Partikelauswahl verwenden. Obwohl die Methode in der Lage ist, über 50 % der Partikel aus dem endgültigen Stapel herauszufiltern, bleiben die Herkunft dieser weggeworfenen Partikel und die zugrunde liegenden Gründe für ihren vernachlässigbaren Beitrag zur Rekonstruktionsqualität unklar. Diese Verständnislücke erfordert zusätzliche Forschung, um diese Einschränkung umfassend anzugehen und möglicherweise zu beheben.

Es gibt drei mögliche Methoden der Partikelsortierung oder Partikelsiebung. Zunächst einmal kann cisTEM⁴ für jedes einzelne Partikelbild nach der 3D-Verfeinerung eine Punktzahl melden. Benutzer können Partikel mithilfe des cisTEM-Scores sortieren, um Partikel zu verwerfen. Der Winkelgraph-Konsistenz-Ansatz (AGC)¹⁷ ist auch ein Verfahren zum Verwerfen falsch ausgerichteter Partikel. Darüber hinaus ist die Nichtausrichtungsklassifizierung⁵ eine traditionelle Methode, um Partikel mithilfe der 3D-Klassifizierung zu verwerfen. Wir verglichen die Qualität der mit diesen Methoden zurückgehaltenen Partikel mit CryoSieve und stellten fest, dass die zurückgehaltenen Partikel von CryoSieve von höherer Qualität sind¹⁵. Das hier vorgestellte Verfahren übertrifft alternative Verfahren deutlich und erreicht die geringste Anzahl von Partikeln bei gleicher Auflösung.

Wie das Ergebnis zeigt, trägt die Mehrheit der Partikel in einem Kryo-EM-Endstapel nicht zur Rekonstruktion der Dichtekarte bei. Mit anderen Worten, unter allen Partikeln, die während der Bildaufnahme gesammelt werden, tragen nur einige wenige, nämlich die feinste Teilmenge, tatsächlich zur endgültigen Rekonstruktion bei. Folglich könnte das Verhältnis dieser letzten Teilmenge zur Gesamtzahl der gesammelten Partikel als quantitative Metrik für die Beurteilung der Probenqualität dienen. Je höher dieses Verhältnis, desto besser ist die Probenqualität. Trotz technischer Fortschritte, die die Kryo-EM für Strukturbiologen zugänglicher gemacht haben, bleibt die Probenvorbereitung ein großer Engpass im Arbeitsablauf. Naturwissenschaftler und Ingenieure konzentrieren sich daher auf diese Herausforderung²⁵. Bei der Einzelpartikelanalytik (SPA) besteht die Probenvorbereitung aus zwei entscheidenden Schritten: der Probenoptimierung und der Gittervorbereitung. Ersteres beinhaltet die Reinigung der Probe unter Beibehaltung ihres optimalen biochemischen Zustands. Letzteres beinhaltet die Vorbereitung der Probe für die Analyse im Mikroskop, einschließlich chemischer oder Plasmabehandlung des Gitters, Probenabscheidung und Vitrifizierung. Zahlreiche Techniken wurden vorgeschlagen, um makromolekulare Instabilität zu beheben, aber die Wirksamkeit eines Ansatzes gegenüber einem anderen hängt von den Eigenschaften der Probe ab^25,26. Derzeit werden die Ergebnisse der Netzvorbereitung stark von der Expertise und Erfahrung des Benutzers beeinflusst, was den Prozess zeitaufwändig und herausfordernd machen kann^27,28. Die zahlreichen Variablen, die bei der Proben- und Gittervorbereitung auftreten, stellen eine Herausforderung bei der Feststellung von Ursache-Wirkungs-Beziehungen dar, da die Forscher die Probe nur auf molekularer Ebene mit dem Mikroskop beurteilen können. Infolgedessen fehlen noch quantitative Statistiken aus Vergleichen verschiedener Proben- und Gittervorbereitungsprotokolle, und ein systematischer Ansatz ist notwendig, um Trends zu untersuchen und die grundlegenden Mechanismen des Probenverhaltens zu verstehen²⁹.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc. Toronto, Canada		CryoSPARC (Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification) is a state of the art HPC software solution for complete processing of single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) data. CryoSPARC is useful for solving cryo-EM structures of membrane proteins, viruses, complexes, flexible molecules, small particles, phase plate data and negative stain data.
EMPIAR-10097 Dataset		https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs	This dataset comprises single-particle cryo-EM data of the Influenza Hemagglutinin trimer, characterized by its highly preferred orientation, collected using a 40-degree tilted collection strategy.
initial.mrc		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
mask.mrc		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
RELION		4.0-beta-2	RELION (REgularised LIkelihood OptimisatioN) is an open-source software for cryo-electron microscopy (cryo-EM) data processing, particularly for refining macromolecular structures. Utilizing a Bayesian approach, it excels in separating signal from noise, enabling high-resolution structure determination. RELION supports single-particle analysis, tomography, and sub-tomogram averaging, and has become widely used in structural biology due to its effectiveness and user-friendly interface.
T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097	Metadata file for the final stack of particles from EMPIAR-10097