Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Department of Defense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124) unterstützt, U54CA143876 von der National Cancer Institute, und der Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Wir würden uns für die Bereitstellung von HUVECs Herrn Dr. Annarita Lorenzo (Institut für Pathologie) zur Bereitstellung von VE-Cadherin-Antikörper danken und Dr. Marco Seandel (Abteilung für Chirurgie).

1. Kultivierung HUVECs auf Mikroobjekttragerglaschen für Observing CTC-Endothel-Interaktionen <ol><li> Unter der Gewebekultur Kapuze, zuerst den Mikroobjekt spülen, Kanalbreite von 1 mm mit PBS. Sanft Beschichtung der Mikroobjekt mit 200 ul von 50 ug / ml Fibronektin (gelöst in PBS) unter Verwendung einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze. </li><li> Decken Sie die Mikroobjekt mit dem Deckel und halten Sie sie in der Gewebekultur Haube für 30 min. Langsame Abgabe der Flüssigkeit in den Mikroobjekt verhindert Blasenbildung im Kanal. </li><li> Perfuse 200 &amp;mgr; l warme (37 ° C) HUVEC-Wachstumsmedium (M199-Medium, 1 M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml Heparin, 100 ug / ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor und L-Glutamin) auf der Mikroobjekt inkubieren 20 min bei RT. Während der Perfusion, bereiten HUVEC Zellsuspension. </li><li> Spülen HUVECs mit PBS und fügen 0,05% Trypsin-EDTA für 1-2 min bei RT. Zentrifuge HUVECs in 2 ml Wachstumsmedium bei 180 × g für 5 min. </li><li> Messen Sie die Zellkonzentration mit Hilfe eines neubauer Hämozytometers und bereiten 10 7 HUVEC Zellen/100 ul Wachstumsmedium. Dann vorsichtig aus dem Einlass des Mikroobjekt mit einer 200-ul Pipettenspitze entfernen das Medium. </li><li> Bringen Sie die Mikroobjekt auf Augenhöhe und mit einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze vorsichtig perfuse 200 ul der vorbereiteten Konzentration von HUVECs in den Kanal. Vorsicht ist bei diesem Schritt erforderlich ist, um Blasenbildung zu verhindern. Wenn die Blasen erscheinen, halten Perfusion für eine etwas längere Zeit, bis sich Blasen geben Sie den Ablaufkanal. </li><li> Setzen einer gleichen Menge (~ 80 &amp;mgr; l) von HUVEC Medien sowohl dem Einlass und Auslass des Mikroobjekt. Dies verhindert den Fluss von Zellen in jeder Richtung. </li><li> Decken Sie die Folie und halten Sie es in den Inkubator (37 ° C) für 1,5 Stunden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Flusskammer Versammlung für Übernachtung HUVEC Kultur auf einem Microslide <ol><li> Legen Sie eine sterile 20-ml-Spritze, weiblichen und männlichen Luer-Anschlüsse, Schläuche und eine Spritzenpumpe im Inkubator für 15 kmn. </li><li> Für minimale Totvolumen, verwenden Sie die Schläuche mit Innendurchmesser von 0,04 Zoll. Kleinere Rohrdurchmesser verhindert Blasenbildung. </li><li> Füllen die 20-ml-Spritze mit warmem (37 ° C) HUVEC-Medium (12 ml). Befestigen Sie die Schläuche mit den Anschlüssen auf die Spritze. Entfernen Sie die Luftblasen. Verbinden Sie dieses Anordnung an der Mikroobjekt. </li><li> Vollständig zu füllen den Einlass des Mikroobjekt mit HUVEC Medien. Bringen des gefüllten 20-ml-Spritze an dem Verbinder angebracht neben dem Mikroobjekt. Den Stecker zu befestigen vorsichtig auf die Mikroobjekt. </li><li> Bringen Sie das Set-up in den Inkubator und verbinden Sie es mit der Spritzenpumpe, bei 10 ml / min Scherrate eingestellt. Lassen Sie die Zellen O / N im Brutschrank bei 37 ° C </li><li> Am nächsten Tag, zerlegen den Aufbau durch Entfernen des Verbinders an dem Einlass des Mikroobjektträger befestigt. </li><li> Um E-Selektin-Expression auf Endothelzellen hochregulieren, bereiten Sie frisches Wachstumsmedium mit IL-1β bei 10 ng / ml in 4 ml Medium. Saugen Sie das Medium in einem 10-ml-Spritze. T entfernener Medium aus dem Einlass des Mikroobjekt und der Spritze zu verbinden, um die Folie. </li><li> Stellen Sie die Spritzenpumpe mit 10 ul / min Schergeschwindigkeit für 4 Stunden in den Brutschrank. </li></ol> 3. Herstellung von anti-PSMA (J591-488) gekennzeichnet Prostatakrebszellen <ol><li> Während IL-1β Inkubation von HUVECs, bereiten anti-PSMA-J591-Alexa488 PCa-Zellen. Hinzufügen von 0,05% Trypsin-EDTA-MDA-Zellen für 1 min. Nicht die Zellen Trypsin für längere Zeit ausgesetzt werden, da sie die auf der Zelloberfläche vorhanden Glycopeptide beeinflussen. Enzym-freie Zelle Dissoziation Reagenz kann auch anstelle von Trypsin verwendet werden. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren MDA Zellpellet in 1 ml H / H-Puffer (Hanks balanced salt solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl 2). In anti-PSMA-J591-Alexa488 Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort. Resuspendieren der Zellen während der Inkubation. </li><li> Nach 30 min Zentrifugation der Zelllösung bei 800 × g für 5 min. AspiRate und das Pellet in 1 ml H / H-Puffer. Zählen Sie die markierten Zellen und MDA bringen die Endkonzentration auf 1x10 6 Zellen / ml. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit J591-488 markierten Zellen MDA und die Bläschen. </li></ol> 4. Vorbereitung der Anti-PSMA (J591-488) beschriftet CTC Enriched von PCa Patienten <ol><li> Sammeln Sie 7,5 ml Blut von Patienten mit Prostatakrebs in einem blauen Kappe Rohr (mit Na-Citrat). Sanft Blut verdünnen 01.01 in 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS. </li><li> Add 5.3 ml Ficoll-Paque Plus in einem 50 ml konischen Röhrchen. Schicht verdünntes Blut auf dem Ficoll-Paque. Zentrifugieren bei 400 g für 30 min. </li><li> Vorbeschichtung alle Rohre oder Spitzen in Kontakt mit CTC mit 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl 2 (R / S-Puffer) nicht-spezifische Bindung von CTC an den Oberflächen zu verhindern. Aufrechtzuerhalten 4 ° C Temperatur der Medien und Puffer in Kontakt mit CTC. </li><li> Das Blut peripheren mononuklearen Zellen (PBMCs)-Fraktionenthält CTC von der Schnittstelle in einem anderen 50-ml konischen Röhrchen, enthaltend 30 ml R / S-Puffer. Zentrifugieren bei 400 g für 8 min. </li><li> Das Pellet und waschen wieder in R / S-Puffer bei 400 g für 8 min. Nach der Zentrifugation das Pellet in H / H-Puffer. In anti-PSMA-J591-488-Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort. </li><li> Nach 30 min zentrifugieren die PBMCs enthält J591-488 markierten CTC bei 800 g für 5 min. Resuspendieren in H / H-Puffer. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze (mit R / S-Puffer vorgezogen) mit der Probe. </li></ol> 5. Herstellung von Mikroskop, Spritzenpumpe und Durchflusskammerversammlung <ol><li> Schalten Sie den umgekehrten Mikroskop und stellen Sie die Beleuchtung bei Kohler 10X-Objektiv. Bringen Sie die Spritzenpumpe auf dem gleichen Niveau wie der Probentisch des Mikroskops und setzen Sie ihn auf 1 dyn / cm 2 Schubspannung (~ 10 ml / min). </li><li> Öffnen Sie die Zeiss Axiovision Software. Wählen Sie das Ziel auf dem Computer-Bildschirm. Erstellen Sie eine neueOrdner unter der Option-Tools in der Software. </li><li> Öffnen Sie die Option Smart-Experimente in Axiovision und die Einstellungen zu kurzen 30 Sekunden Videos für 30 Minuten aufzeichnen. </li><li> Für die Live-Videofluoreszenz, stellen Sie die Bildoptionen-12 ms Belichtungs, 2 x 2 bin, 5 zu gewinnen. Diese Parameter helfen bei der Erreichung Videos der Nähe des Video-Bildrate (~ 23 Bildern pro Sekunde) mit der Zeiss MRM-Kamera. </li><li> Um die volle Breite des Strömungskanals bei 10 X Ziel auf dem Bildschirm sichtbar zu machen, mit einem C-Mount-Adapter (0,63 mm xf/60 Interface). </li><li> Schalten Sie den Quecksilberlampe. </li><li> Legen Sie die Spritze und den Stecker mit den Zellen auf den Spritzenpumpe. </li><li> Bringen IL-1β stimulierten HUVECs aus dem Inkubator. Befestigen Sie den Stecker mit dem gefüllt Einlasskanal des Mikroobjekt enthält HUVECs. </li><li> Verbinden der Austrittskanal mit dem Anschluss an die Rohrleitung angebracht ist. Setzen Sie den Schlauch in eine Schale oder 15 ml konischen Röhrchen, um die Strömung durch sammeln. </li><li> Starten Sie den infusiauf durch die Mikroobjekt bei 10 ul / min. Beachten Sie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Zellen der Bezeichnung MDA oder markierte CTC von Patienten unter 488-nm-Filter auf der Epifluoreszenzmikroskop abgeleitet. </li><li> Starten Sie die Aufnahme des Experiments als 30 Sekunden kurze Videos. Während der Wiedergabe Analyse, messen die Walzgeschwindigkeit. Walzgeschwindigkeit wird durch Division des Abstandes von den Zellen über die Zeit zurück gemessen. </li></ol> 6. Immunfärbung des Microslide <ol><li> Druckmaterial aus dem Einlaß und Auslaß der Mikroobjekt nach Perfusion MDA-Zellen auf IL-1β-stimulierten HUVEC-Zellen für 10 min. </li><li> Verwendung einer 200 ul-Spitze, setzen warm (37 ° C) PBS, das Calcium und Magnesium in den Einlass des Mikroobjektträger für 5 min. Neigen Sie den Mikroobjekt mit seinem Deckel als Stütze auf der Bank. Halten Sie die Mikroobjekt in einer gekippten Position für alle Inkubationen während Immunfärbung. </li><li> Fix HUVECs durch Perfusion warmen 2% Formaldehyd in den Einlass </li><li&gt; Inkubieren für 20 min bei RT. Gründlich zweimal mit PBS für jeweils 5 min. </li><li> Hinzufügen Triton-X 100 (0.1%) in 5% BSA in PBS für 10 min bei RT. </li><li> Gründlich zweimal mit PBS für jeweils 5 min. Blockieren mit 5% BSA in PBS für 30 min. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper Ziege-anti-VE-Cadherin (1:100) in 2,5% BSA O / N bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In Sekundär Esel-anti-Ziege-647-Antikörper für 45 min. Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. </li><li> Inkubation bei RT mit humanisierten J591-Alexa488 konjugierte Antikörper für 1 Stunde. </li><li> Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In DAPI für 5 min. Waschen mit destilliertem Wasser für 5 min. </li><li> In PBS (Mowiol oder für langfristige Lagerung). Visualisieren Sie die Mikroobjekt unter dem konfokalen Mikroskop. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. 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S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development.">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li><li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion.">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li></ol>

Dr. Bander ist der Erfinder von Patenten, die Cornell Research Foundation (&quot;CRF&quot;) für die Antikörper-J591 in diesem Artikel verwendet zugeordnet sind. Dr. Bander ist Berater und besitzt Lager in BZL Biologics, des Unternehmens, dem die Patente wurden von CRF für die weitere Forschung und Entwicklung lizenziert.

Aufgrund der geringen Anzahl von CTC unter Blutzellen, ist es schwierig, CTC als reine Population von Zellen zu isolieren. Um CTC / EC-Interaktionen zu untersuchen, die seltene und unreine Bevölkerung von CTC stellt zwei großen Herausforderungen: a) Identifikation von CTC unter Blutzellen; b) Beobachtung der CTC / EC-Interaktionen. Um die erste Einschränkung der Identifizierung Prostata CTC unter Blutzellen zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass praktis...

Metastasierung ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der kaum verstanden bleibt. Der Ligand E-selectin/selectin Achse ist gezeigt worden, eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung durch Förderung der Primär adhäsiven Wechselwirkungen zwischen dem vaskulären Endothel und Krebszellen 1,2 spielen. Endothelzellen (E)-Selectin ist ein Transmembran-Protein von aktivierten Endothelzellen exprimiert wird, während die verschiedenen E-Selektin-Ligand (en) durch Tumorzellen 3 ausgedrückt. Zahlreiche in vitro-Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt, um E-selectin/selectin Ligand-Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Endothelzellen (ECs) 1 zu modellieren. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden verschiedene Durchflusskammer-Systeme eingesetzt, um Blutgefäßsystem zu simulieren. Unter Flusskammer-Einheiten wird Parallelplatten-Durchflusskammer (PPFC) in Verbindung mit ECs routinemäßig als in vitro-Modell simuliert in vivo Scherstressbedingungen eingesetzt. HierinVerfahren ECs auf einem 35-mm-Schale gezüchtet und nach Erreichen einer Monoschicht werden ECs zum PPFC befestigt und Scherspannung basierend Experimente durchgeführt werden. , PPFC und anderen aktuellen Systemen präsentieren jedoch viele Einschränkungen zum Studium adhäsive Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Tumorzellen (CTC) von Patienten und ECs stammen, die vorwiegend, weil CTC sind eine seltene Population von Zellen, aus dem Primärtumor Schuppen, unter den Millionen von zirkulierenden Blutzellen (1 CTC pro 10 9 Blutkörperchen) 4. Daher, im Gegensatz zu unbegrenzten Vorrat an kultivierten Zelllinien, geringe CTC zählt zu sehr wenigen und seltenen CTC / EC-Interaktionen, erfordern richtige Strömung Kanalbreite, um die Interaktionen für die Wiedergabe Analyse aufzeichnen. Darüber hinaus, da Patienten abgeleitet CTC sind eine unreine Bevölkerung, also eine Identifikationsmarkierung ist erforderlich, um in bestimmten CTC verfolgen. Um dieses Problem zu lösen, ein neues Verfahren, um Prostatakrebs zu identifizieren (PCa) CT entwickelten wirCs unter Ausnutzung der Tatsache, daß praktisch alle diese CTC auszudrücken Prostata-spezifischen Membranantigen (PSMA) auf ihrer Zelloberfläche 5,6. In diesem Bericht haben wir die Prostatakrebs-Zelllinie, MDA PCa2b (MDA), um den potentiellen Nutzen von unserem neuen System, um Prostatakrebs, CTC Wechselwirkungen mit ECs Studie zeigen, schließlich, um den Mechanismus der Metastasierung zu verstehen. Unsere Methodik kann für verschiedene Scher basierte Experimente simuliert in vivo Gefäßsystem 9.7 angewendet werden. Neben der Prüfung PCa CTC / EC-Interaktionen, konnte der Stromfluss-Kammer-System leicht für die Analyse von peripheren mononukleären Blutzellen oder Wechselwirkungen Tumorzellen &#39;mit ECs angepasst werden. Die Einfachheit der Demontage und Wiedermontage der Strömungskammer, ein Mikroobjekt III (0,1) (nachstehend als Mikroobjekt bezeichnet), ermöglicht die Kultivierung ECs unter Perfusion und Stimulieren ECs mit verschiedenen Zytokinen induzieren protein Ausdruck. Außerdem kultivierten Endothelzellen, rekombinante Proteine, wie E-und P-Selektin auf der Mikroobjekt und Interaktion mit Tumorzellen, beschichtet werden können, unter laminaren Strömungsbedingungen 10 beobachtet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Microslide</td>
			<td style="width:192px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80331</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Plastic tubing</td>
			<td style="width:192px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">AAQ04103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Male luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Female luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:192px;">Chemyx Inc</td>
			<td style="width:119px;">Fusion 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Luer-lock syringe</td>
			<td style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">M199 medium</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Endothelial Mitogen</td>
			<td style="width:192px;">Biomedical Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BT-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Anti-PSMA J591-488</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Interleukin-1 beta</td>
			<td style="width:192px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Trypsin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SM-2002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Heparin</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">HUVECs</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Marco Seandel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">VE-Cadherin</td>
			<td style="width:192px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10x objective</td>
			<td style="width:192px;">Zeiss Plan Neofluar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">Enzyme free cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S-004-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:192px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ficoll-paque plus</td>
			<td style="width:192px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

Metastasierung ist ein Prozess, in dem Tumorzellen zu vergießen aus dem Primärtumor intravasate Blut Gefäß-und Lymphsystem, damit, den Zugang zu extravasieren und bilden einen Sekundär Nische. Die Extravasation von Tumorzellen aus dem Blutgefäßsystem kann mit Endothelzellen (ECs) und Tumorzellen aus verschiedenen Zelllinien untersucht werden. Erste Studien wurden mit statischen Bedingungen durchgeführt, aber es ist gut dokumentiert, dass ECs anders unter physiologischen Flussbedingungen verhalten. Daher unterschiedlichen Strömungskammeranordnungen werden derzeit zum Studium Krebs-Zell-Interaktionen mit ECs verwendet. Aktuelle Durchflusskammer-Baugruppen bieten reproduzierbare Ergebnisse entweder mit verschiedenen Zelllinien oder Flüssigkeit bei unterschiedlichen Scherstressbedingungen. Jedoch zu beobachten und zu studieren Wechselwirkungen mit seltenen Zellen, wie zirkulierenden Tumorzellen (CTC), sind bestimmte Änderungen erforderlich, um das herkömmliche Strömungskammer-Anordnung hergestellt werden. CTCsind eine seltene Zellpopulation unter Millionen von Blutzellen. Folglich ist es schwierig, eine reine Population von CTC erhalten. Kontamination der CTC mit verschiedenen Arten von Zellen, die normalerweise im Blut gefundenen unvermeidlich mit vorliegenden Anreicherung oder Abreicherung Techniken. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine einzigartige Methode zur fluoreszenz Label zirkulierenden Prostatakrebszellen und studieren ihre Wechselwirkungen mit ECs in einer selbstorganisierten Flusskammer-System. Diese Technik kann weiter verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Prostata-CTC und jedes Protein von Interesse zu beobachten.

Figur 1 zeigt ein O / N-Kultur von einer Monoschicht von Endothelzellen auf der Mikroobjekt. Die Skalierungen auf Fig. 1A zeigt, dass 100% der Mikroobjekt sichtbar mit 5X Ziel, während 70% sichtbar mit einem 10X-Objektiv (Abbildung 1B). Für E-Selektin-vermittelte Wechselwirkungen werden die Zellen rollen an den Kanten nicht berücksichtigt, die mehr als 70% der Mikroobjekt verfügbar für Video-Aufnahme und-Wiedergabe Analyse macht. In unserer Erfahrung, zunächst die...

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In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Unser Bericht beschreibt eine einzigartige Methode zur Visualisierung und Analyse von CTC / EG Wechselwirkungen bei Prostatakrebs unter physiologischen Flussbedingungen.

In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

9.0K Aufrufe.  Weill Cornell Medical College.  Unser Bericht beschreibt eine einzigartige Methode zur Visualisierung und Analyse von CTC / EG Wechselwirkungen bei Prostatakrebs unter physiologischen Flussbedingungen. 

Serie: In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Forschung

Medizin

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...