Nous remercions sincèrement les membres du Laboratoire Marder. Nous remercions notre conseiller, la Dre Eve Marder, pour son soutien et ses encouragements. Cette recherche a été financée par l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies Subventions NS-17813 et NS-058 110.

1. Dissection brut <ol><li> Placer un crabe sur la glace pendant 30 minutes pour ternes les systèmes sensoriels et moteurs de l&#39;animal. L&#39;entourent sur tous les côtés avec de la glace. Les gants doivent être portés lors de la manipulation du crabe. </li><li> Préparez-vous à la dissection brute en posant la poêle dissection et les outils que vous allez utiliser. Rongeurs, os de coupe ciseaux, petits ciseaux, pince à griffes, une spatule avec un bord effilé, un noir Sylgard revêtement plat, et les broches d&#39;insectes sont nécessaires. </li><li> Retirer le crabe du seau à glace par sa patte arrière pour l&#39;empêcher de pincement et le placer dans la casserole de dissection. </li><li> Retirez les premières griffes en tournant chacun vers l&#39;intérieur. Ensuite, retirer chaque jambe en utilisant le mouvement de torsion même. </li><li> Utilisation de la pince gouge, retirez le maxillaire se couvrir la bouche. Retirez également la maxillule doux. </li><li> Utilisation de la pince gouge à nouveau, à partir de l&#39;extrémité latérale postérieure de la carapace et obtenir une bonne adhérence sur le bord de celui-ci. Etouffer les rongeurs et de briser ce morceau de la carapace hors tension. Prendre soin d&#39;enlever la carapace assez pour permettre à la spatule pour entrer dans l&#39;ouverture. Continuez à supprimer le bord de la carapace jusqu&#39;aux yeux et répétez de l&#39;autre côté. </li><li> Avec le côté effilé de la spatule, grattez délicatement le tissu mou intérieure loin du toit de la carapace dorsale. Gardez la spatule en contact avec la carapace pour éviter d&#39;endommager l&#39;STNS. Utilisez la pince gouge à rompre avec les parties de la carapace qui ont été séparés du tissu. Également séparer certains des tissus mous de la carapace ventrale en prenant soin de séparer les muscles adducteurs attacher le tissu de la carapace. </li><li> Rompre la carapace dorsale postérieure autant que le cœur, où il ya deux petits osselets en saillie de la carapace. Coupez aussi loin que possible antérieure. Stabiliser le céphalon (le «visage») avec un doigt tout en rompant avec les parties les plus antérieure de la carapace dorsale. </li><li> Sur la face ventrale de la carapace, tirez celui mandibules à la fois par l&#39;ancrage de la pince gouge sur une mandibule, tordant leur extérieur pour déloger la mandibule de l&#39;épistome attaché, et l&#39;écartant. Deux longues osselets avec les muscles doivent être joints à la mandibule extraite si c&#39;est fait correctement. </li><li> Écartent le tissu sur les côtés du céphalon près des yeux à l&#39;aide de la spatule. Avec des ciseaux de dissection petit coupé à travers le tissu le plus près de la crête de osselet comme couche par couche possibles. </li><li> Reste le crabe contre une paroi de la casserole de dissection et le soutenir en le fixant en place (les griffes peut être utilisé pour cela). Couper le labrum (&quot;lèvre supérieure&quot;) de l&#39;épistome veillant à ne laisser aucun tissu attaché. L&#39;utilisation d&#39;os de coupe ciseaux faire deux coupes en diagonale dans la carapace ventrale pour enlever le céphalon. </li><li> Prenez le labrum avec une pince à dents et couper la lèvre (&quot;lèvre inférieure&quot;) loin de l&#39;osselet sur la face ventrale. Puis soulevez doucement la lèvre loin de la carapace ventrale restantes. Utilisez des ciseaux petits de séparer la partie ventrale de l&#39;estomac du tissu tapissant la carapace. Lorsque les ampoules pyloriques sont visibles, couper l&#39;estomac loin de le tissu de chaque côté de celui-ci jusqu&#39;à ce que l&#39;estomac est extraite du crabe. </li><li> Tout en maintenant l&#39;estomac par la lèvre avec une pince, le repos de l&#39;estomac contre la paume de la main et versez une solution saline dans la bouche. Cela élargit l&#39;estomac et le rend plus facile à ciel ouvert. Couper de l&#39;ouverture à la bouche vers le bas entre le droit du pylore travers l&#39;osselet entre les ampoules. Puis couper en diagonale vers le bas par les deux branches cardiaques. Coupez les pointes des trois dents à l&#39;intérieur de l&#39;estomac. </li><li> Placez le ventre sur une grande, noir, Sylgard revêtement plat avec l&#39;intérieur de l&#39;estomac vers le bas. Pin bas des cinq coins de la préparation avec des épingles d&#39;insectes et de remplir le plat avec une solution saline froide, plongeant toute la préparation (voir figure 1). </li></ol> 2. Dissection fine <ol><li> , Micro-dissection sont les outils nécessaires pour la dissection fine. En particulier, pinces et de ciseaux à ressort sont nécessaires aussi bien en tant que titulaire broches avec une aiguille de tungstène. Un clair, Sylgard enduits, boîte de Pétri et des épingles fil fin devrait également avoir été préparé. </li><li> Dès le grossissement le plus faible, commencez par mettre le doigt sur les rabats près de la lèvre qui l&#39;habitude d&#39;être l&#39;ouverture bouche. Réorganiser le reste des broches pour faire la préparation tendue et la broche tous les autres secteurs nécessaires. </li><li> Soulevez délicatement l&#39;hypoderme repéré couvrant la partie inférieure de la préparation et la garniture en laissant dans un patch de l&#39;hypoderme avec deux points blancs. </li><li> Peler les jaunes, vaporeux, tissu membraneux près du fond de la préparation. Le mvns sont faiblement attaché à la face de ce tissu. Séparez délicatement l&#39;mvns du tissu jaune comme il est tiré vers le haut. Suivez les tissus jaunes et coupé aux côtés du cerveau. </li><li> Suivez le processus de sortie du cerveau d&#39;épaisseur qui s&#39;étendent laterally. Ce sont les nerfs commisural. Une fois l&#39;extrémité du nerf commissural est atteinte, retirer la masse de spongieux, le tissu blanc cassé qui a été coupé du côté du cerveau. </li><li> Lorsque les ions et fils rencontrent les Cogs, couper les tissus musculaires et de révéler la longueur des ions et des fils. </li><li> Retour au patch hypoderme repéré et le couper. Ceci devrait laisser une ouverture de l&#39;artère qui entoure la STG. Couper à travers l&#39;ouverture de séparer les deux muscles qui entourent la STG. Soulever les extrémités de ces muscles et couper juste en dessous d&#39;eux pour les séparer de l&#39;artère et d&#39;exposer les alns et AGNS. Séparez les muscles flanquant aussi loin que le cartilage couché sur le RTC. </li><li> Coupez le tissu artériel autour de la STG jusqu&#39;à l&#39;endroit où l&#39;mvns, DGN, et dvn rencontrer. Travailler le bas du DVN à l&#39;LVNs et couper à travers l&#39;blanchâtre, tissus délicats couvrant les LVNs. </li><li> Localisez le psn sur l&#39;osselet près du fond de la préparation. Le PSN peut être utilisé pour localiser les LVN et la jonction dlvn. </li><li> Suivant suivre les dlvn bas pour localiser le PYN et PDN. Les enveloppements PYN souvent sur l&#39;ampoule à l&#39;ouverture du pylore. Le PDN bifurque de l&#39;dlvn et est entre les pylorique ampoule et les muscles cardio pylore. Laissez un peu de muscle attaché à l&#39;un de ces nerfs, car ils peuvent facilement être confondues lorsque la préparation est transférée à l&#39;antenne claires Sylgard. </li><li> Une fois que tous les nerfs ont été découverts, de rompre toute connexions restantes entre les STNS et les nerfs des tissus et non désirés de l&#39;estomac. Soigneusement déplacer le STNS loin du reste de l&#39;estomac, la coupe des correspondances manquées. </li><li> Condition du plat Sylgard clair avec la masse restante des tissus de l&#39;estomac en le frottant sur la surface de l&#39;Sylgard jusqu&#39;à ce que le Sylgard ne se sent plus trop collant ou sec. Sylgard est hydrophobe et la STNS adhèrent fortement à elle si le plat Sylgard revêtement n&#39;est pas conditionnée de cette manière. </li><li> Ajoutez un peu de solution saline froide à l&#39;antenne. Prenez les extrémités supérieures des nerfs commissuraux avec des pinces et amener le STNS au plat claires Sylgard. </li><li> Epingler la STNS bas sur le Sylgard. Sever le cerveau par les nerfs commissuraux et utiliser les broches Minuten pour sécuriser les quatre extrémités des rouages ​​en premier lieu. Assurez-vous que la préparation est à l&#39;endroit en vérifiant que le IVN est pointée vers le haut loin du Sylgard. La DGN doit sortir légèrement sous la STG lorsque la STG est du bon côté. Pin le reste du nerf se termine vers le bas avec les goupilles de fil fin. </li><li> Nettoyez toute musculaires restantes ou les tissus de la STNS. </li><li> Desheath le STG utilisant un support et une tige légèrement crochu, fine aiguille de tungstène,. Faire un petit trou dans un coin de la gaine STG loin du corps cellulaire et l&#39;utilisation que le trou d&#39;obtenir entre les couches de la gaine. Découpez soigneusement un rabat de la gaine séparée pour exposer le neuropile STG et les corps cellulaires. </li><li> Pin toute volets de la gaine vers le bas pour augmenter l&#39;accessibilité aux organes de la cellule et de stabiliser la STG pour les enregistrements intracellulaires. Re broches du reste de la STNS veillant à ce que chaque nerf est tendu et bien espacés pour l&#39;enregistrement extracellulaire (voir figure 3). </li></ol> 3. Résultats <ol><li> Idéalement, toutes les nerfs doivent être libres d&#39;entailles et des dommages, en particulier celles qui seront enregistrées à partir. Aucun des nerfs emmêlés devrait être ou tordu. Le STG doit être intact avec tous les cellules disposées dans une formation autour de la barbe neuropile. Le STNS intacte est bilatéralement symétrique et ressemble à un homoncule avec le LVNs que les jambes, le mvns que les armes et l&#39;extrémité antérieure de la tête. </li></ol> Abréviations: <table border="1"><tbody><tr><td> STNS </td><td> Stomatogastric du système nerveux </td></tr><tr><td> STG </td><td> Ganglionnaires Stomatogastric </td></tr><tr><td> CoG </td><td> Ganglionnaires commissurales </td></tr><tr><td> OG </td><td> Ganglion œsophagien </td></tr><tr><td> mvn </td><td> Nerf médian du ventricule </td></tr><tr><td> ions </td><td> Inférieur nerf oesophagien </td></tr><tr><td> le fils </td><td> Supérieur nerf oesophagien </td></tr><tr><td> AGN </td><td> Nerveuses antérieures gastriques </td></tr><tr><td> aln </td><td> Antérieur nerf sciatique </td></tr><tr><td> dgn </td><td> Dorsale du nerf gastrique </td></tr><tr><td> dvn </td><td> Nerf dorsal du ventricule </td></tr><tr><td> LVN </td><td> Nerveuses du ventricule latéral </td></tr><tr><td> psn </td><td> Nerveuses estomac postérieur </td></tr><tr><td> PYN </td><td> Nerveuses pylorique </td></tr><tr><td> pdn </td><td> Nerf dilatateur pylorique </td></tr><tr><td> dlvn </td><td> Branche dorsale du nerf du ventricule latéral </td></tr><tr><td> IVN </td><td> Nerveuses ventriculaires inférieures </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1207/figure_1_90ppi.jpg" alt= &quot;Figure 1&quot; /&gt; Figure 1: Schéma illustrant le placement approximatif de la STNS dans l&#39;estomac avant de dissection. <img src="/files/ftp_upload/1207/figure_2_90ppi.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Schéma des différents muscles dans la partie inférieure de l&#39;estomac et une superposition des STNS en vert clair. Chaque type de cellule dans la STG est répertorié avec les muscles, ils sont connus pour innerver. Cette carte est utile pour la planification de disséquer un nerf qui transporte un signal provenant d&#39;une cellule donnée (avec la permission du laboratoire de Nadim). <img src="/files/ftp_upload/old/1207_2009_1_12_5/figure_3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: Schéma de l&#39;STNS avec des électrodes intracellulaires et extracellulaires puits (de Marder et Bucher, 2007).

<ol>
	<li>Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , (1992).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs.">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li><li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus,+Homarus+Americanus+and+Panulirus+argus+(Decapoda+crustacean).">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).</li><li>Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stomatogastric+Nervous+System:+Structure+and+function+of+a+small+neural+network.">The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network.</a> Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).</li></ol>

La dissection STNS est la première étape dans l&#39;exécution d&#39;une expérience ou électrophysiologie immunohistochimie, ou pour obtenir des cellules pour la culture cellulaire. Indépendamment de l&#39;expérience prévue, la dissection brute restera inchangée. Cependant, la dissection fine peut varier. Il est important de planifier à l&#39;avance du temps que les cellules des nerfs et qui vous enregistrer. La plupart des neurones dans la STG ont des processus qui innervent les muscles au moins un dans l&#39;...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Black Sylgard 170</td>
<td>Other</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>170</td>
<td>Gross Dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine Scissors</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>14090-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect Pins size 6</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>26000-65</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mayo Scissors</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>14110-17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Spatula</td>
<td>Surgery</td>
<td>Ward Sci.</td>
<td>15 V 4313</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rongeurs</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>16000-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Forceps</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>11021-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter)</td>
<td>Surgery</td>
<td>California Fine Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps #5</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>91150-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minuten Pins</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Moria Spring Scissors (7mm blades)</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>15370-52</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri Dish (100x15mm)</td>
<td>Other</td>
<td>Fischer	</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pin Holder</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>26018-17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Super fine forceps #5SF</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 182</td>
<td>Other</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>182</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten Needles</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>10130-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Wild</td>
<td>MC3</td>
<td>Misc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Jonah Crab (C. borealis)</td>
<td>Animal</td>
<td>Commercial Lobster</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
						
		</div>

cancer borealis stomatogastric nervous system dissection

Le ganglion stomatogastric (STG) est un excellent modèle pour étudier les interactions cellulaires et le réseau, car il contient un nombre relativement restreint de cellules (environ 25 en C. borealis) qui sont bien caractérisés. Les cellules de la STG présentent un large éventail de sorties et sont responsables de l&#39;action motrice de l&#39;estomac. L&#39;estomac contient le moulin gastrique qui décompose les aliments avec trois dents internes, et le pylore qui filtre la nourriture avant qu&#39;elle atteigne l&#39;intestin moyen. Le STG produit deux sorties rythmiques pour contrôler le moulin gastrique et le pylore connue en tant que générateurs motif central (GPC). Chaque cellule dans la STG peuvent participer à l&#39;une ou l&#39;autre de ces rythmes. Ces GPC permettre l&#39;étude de la neuromodulation, l&#39;homéostasie, la variabilité cellulaire et réseau, développement du réseau, et la reprise du réseau. La dissection du système nerveux stomatogastric (STNS) du crabe nordique (Cancer borealis) se fait en deux parties: la dissection fine et globale. Dans la dissection brute de l&#39;estomac entier est disséqué du crabe. Pendant la dissection fines du STNS est extraite de l&#39;estomac à l&#39;aide d&#39;un microscope de dissection et de micro-dissection des outils (voir figure 1). Le STNS comprend les STG, le ganglion œsophagien (OG), et les ganglions commissuraux (CG) ainsi que les nerfs qui innervent les muscles du ventre. Ici, nous montrons comment effectuer une dissection complète de l&#39;STNS en préparation pour une expérience électrophysiologie où les cellules dans la STG seraient enregistrées à partir intracellulaire et les nerfs périphériques seraient utilisées pour des enregistrements extracellulaires. La bonne technique pour trouver les nerfs désirée est affichée, ainsi que notre technique de dégainage le ganglion de révéler le soma et le neuropile.

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Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Le système nerveux stomatogastric (STNS) du crabe nordique (<em&gt; C. boréales</em&gt;) Peut être utilisé pour l&#39;électrophysiologie, l&#39;immunohistochimie, et les études de culture cellulaire. L&#39;extraction STNS se fait en deux parties: la dissection fine et globale.

Cancer borealis Stomatogastric dissection du système nerveux

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

cancer-borealis-stomatogastric-nervous-system-dissection

Research

JoVE Journal

Biology

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

12.4K vues.  Brandeis. Le système nerveux stomatogastric (STNS) du crabe nordique ( C. boréales) Peut être utilisé pour l'électrophysiologie, l'immunohistochimie, et les études de culture cellulaire. L'extraction STNS se fait en deux parties: la dissection fine et globale.

Vidéo: Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection des ovaires chez la drosophile

Recherche

Biologie

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the immune response to an infection of the CNS, such as poliomyelitis, Lyme neuroborreliosis, or neurosyphilis, it is often necessary to isolate the CNS-infiltrating immune cells.
In this video-protocol we demonstrate how to isolate mononuclear cells (MNCs) from the CNS of a rat with EAE. The first step of this procedure requires a cardiac perfusion of the rodent with a saline solution to ensure that no blood remains in the blood vessels irrigating the CNS. Any blood contamination will artificially increase the number of apparent CNS-infiltrating MNCs and may alter the apparent composition of the immune infiltrate. We then demonstrate how to remove the brain and spinal cord of the rat for subsequent dilaceration to prepare a single-cell suspension. This suspension is separated on a two-layer Percoll gradient to isolate the MNCs. After washing, these cells are then ready to undergo any required procedure. 
Mononuclear cells isolated using this procedure are viable and can be used for electrophysiology, flow cytometry (FACS), or biochemistry. If the technique is performed under sterile conditions (using sterile instruments in a tissue culture hood) the cells can also be grown in tissue culture medium. A given cell population can be further purified using either magnetic separation procedures or a FACS.

In this video we demonstrate how to isolate mononuclear cells from the central nervous system of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis.

Isolement de cellules mononucléées du système nerveux central de rats avec EAE

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophile larvaire JNM Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

With the goal of understanding how nervous systems produce activity and respond to the environment, neuroscientists turn to model systems that exhibit the activity of interest and are accessible and amenable to experimental methods. The stomatogastric nervous system (STNS) of the American lobster (Homarus americanus; also know was the Atlantic or Maine lobster) has been established as a model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation of networks. The STNS consists of 3 anterior ganglia (2 commissural ganglia and an oesophageal ganglion), containing modulatory neurons that project centrally to the stomatogastric ganglion (STG). The STG contains approximately 30 neurons that comprise two central pattern generating networks, the pyloric and gastric networks that underlie feeding behaviors in crustaceans1,2. While it is possible to study this system in vivo3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. Physical isolation of the STNS in a dish allows for easy access to the somata in the ganglia for intracellular electrophysiological recordings and to the nerves of the STNS for extracellular recordings. Isolating the STNS is a two-part process. The first part, dissecting the stomach from the animal, is described in an accompanying video article4. In this video article, fine dissection techniques are used to isolate the STNS from the stomach. This procedure results in a nervous system preparation that is available for electrophysiological recordings.

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

We describe the fine dissection of the stomatogastric nervous system from the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Homarus americanus Stomatogastric dissection du système nerveux

With the goal of understanding how nervous systems produce activity and respond to the environment, neuroscientists turn to model systems that exhibit the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other malignancies of the same tissue type, often in a nearby location. Such field defects have been indicated in colon cancer. The molecular abnormalities that are responsible for a field defect in the colon should be detectable at high frequency in the histologically normal tissue surrounding a colonic adenocarcinoma or surrounding an adenoma with advanced neoplasia (well on the way to a colon cancer), but at low frequency in the colonic mucosa from patients without colonic neoplasia.
Using immunohistochemistry, entire crypts within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas or advanced colonic neoplasias were found to be frequently reduced or absent in expression for two DNA repair proteins, Pms2 and/or ERCC1. Pms2 is a dual role protein, active in DNA mismatch repair as well as needed in apoptosis of cells with excess DNA damage. ERCC1 is active in DNA nucleotide excision repair. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 would create cells with both increased ability to survive (apoptosis resistance) and increased level of mutability. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 is likely an early step in progression to colon cancer.
DNA repair gene Ku86 (active in DNA non-homologous end joining) and Cytochrome c Oxidase Subunit I (involved in apoptosis) had each been reported to be decreased in expression in mucosal areas close to colon cancers. However, immunohistochemical evaluation of their levels of expression showed only low to modest frequencies of crypts to be deficient in their expression in a field defect surrounding colon cancer or surrounding advanced colonic neoplasia.
We show, here, our method of evaluation of crypts for expression of ERCC1, Pms2, Ku86 and CcOI. We show that frequency of entire crypts deficient for Pms2 and ERCC1 is often as great as 70% to 95% in 20 cm long areas surrounding a colonic neoplasia, while frequency of crypts deficient in Ku86 has a median value of 2% and frequency of crypts deficient in CcOI has a median value of 16% in these areas. The entire colon is 150 cm long (about 5 feet) and has about 10 million crypts in its mucosal layer. The defect in Pms2 and ERCC1 surrounding a colon cancer thus may include 1 million crypts. It is from a defective crypt that colon cancer arises.

Reduced/absent expression of Pms2 and/or ERCC1 in entire crypts is a frequent event within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas, likely the basis of a field defect with high mutability and progression to cancer. Deficiency in Ku86 or CcOI is much less frequent in these field defects.

PMS2 insuffisantes, ERCC1, Ku86, CCOI des défauts sur le terrain pendant la progression du cancer du colon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native receptor and the ligand are challenging since the ligand of a specific receptor may be unknown and experimental procedures with the native ligand can be technically complicated. To address these obstacles, we describe a reporter system to detect the binding and activation of a specific receptor by a ligand of interest. In this reporter system, the extracellular domain of a specific receptor is conjugated to mouse CD3&#950; and this chimeric protein is then expressed in mouse BW cells. These transfected BW cells can then be incubated with different targets (e.g., cells or antibodies). Activation of a transfected receptor leads to the secretion of mouse interleukin-2 (mIL-2) which can be detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This reporter system has the advantages of being sensitive and specific to a single receptor. In addition, the activation level of a specific receptor can easily be quantified and can be used even in cases where the ligand of the receptor is unknown. This system has been implemented successfully in many of our studies to characterize receptor-ligand interactions. We have recently employed this system to study the activation of human Fc&#947; receptors (Fc&#947;Rs) by different monoclonal anti-CD20 antibodies in clinical use.

This protocol describes how to establish a reporter system that can be used to identify and quantify receptor-ligand interactions.

Un système de BW rapporteur pour étudier les Interactions Ligand-récepteur

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Évaluation des propriétés angiogénétiques des cellules souches du cancer de l’ovaire à l’aide du système de co-culture tridimensionnel, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...