Die Menge an Informationen aus nur einem Experiment ist enorm. Wir können das Vorhandensein dieser Zellwandpolymere erkennen und genau wissen, wie sie in Zellen und Geweben verteilt sind, und sogar ihre Häufigkeit bestimmen. Diese Methode ist so konzipiert, dass sie auf fast jede Art von Pflanzengewebe von jeder Art angewendet werden kann, die man analysieren möchte.
Die Immunlokalisierung in Pflanzengeweben erfordert viel akribische Arbeit, schwer zu erklären, ohne wirklich zu sehen, was passiert. Vor dem Sammeln der Pflanzengewebeprobe eine Glasdurchstechflasche mit genügend kaltfixativer Lösung füllen, um alle Proben vollständig unterWasser zu stellen. Wählen Sie dann die zu analysierenden Pflanzengewebe aus und stutzen Sie die Proben auf eine Größe von nicht mehr als 16 Quadratmillimetern.
Tauchen Sie die Proben sofort in die Fixierlösung ein. Glutaraldehyd und Formaldehyd sind beide ausgezeichnete Fixative, aber beide sind gefährlich und müssen in der Durchflusshaube behandelt werden. Die Durchstechflasche in eine Vakuumkammer übertragen und langsam Vakuum auftragen.
Wenn der Druck negative 60 Kilo Pascal erreicht, beginnt das schwimmende Material in der Durchstechflasche nach unten zu sinken. Halten Sie den Druck in der Kammer bei nicht mehr als negativen 80 Kilo Pascal. Der Sinkvorgang kann bis zu zwei Stunden dauern.
Nachdem die Proben zwei Stunden in der Vakuumkammer gewesen sind, lassen Sie das Vakuum langsam los. Versiegeln Sie die Glasflasche und kühlen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie nach der nächtlichen Fixierung alle Proben, die nicht auf den Boden der Durchstechflasche gesunken sind.
Die restlichen Proben mit 25 Millimolaren PBS 10 Minuten waschen und dann 20 Minuten in 25 Millimolar PIPES Puffer waschen. Es ist äußerst wichtig, alle schwimmenden Proben zu entfernen, da es sehr wahrscheinlich ist, dass das Fixativ nicht in die Probe eingedrungen ist. Dehydrieren Sie die Proben in einer Ethanolserie, tauchen Sie die Proben für 20 Minuten bei jeder Ethanolkonzentration ein.
Um die Proben zu durchdringen, fügen Sie zunehmende Konzentrationen von LR-weißem Harz in Ethanol hinzu, beginnend mit einem Teilharz zu drei Teilen Ethanol. Bei jeder Konzentration 24 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie das LR-weiße Harz durch frisches Harz und brüten Sie die Proben für weitere 12 Stunden bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie die Einbettungsgelatinekapseln vor und wählen Sie Kapseln aus, die etwas größer als die Proben sind, damit die Proben vollständig in das Harz eingeschlossen werden können. Etiketten Papieretiketten mit Bleistift, weil Tinte das Harz verunreinigen wird. Tragen Sie einen Tropfen frisches LR-weißes Harz auf den Boden jeder Kapsel auf.
Legen Sie eine Probe in jede Kapsel, dann füllen Sie die Kapseln bis zur maximalen Kapazität mit frischem Harz. Setzen Sie die Kappe auf die Kapsel und drücken Sie vorsichtig, um sie zu versiegeln. Um das Harz zu polymerisieren, härten Sie die Kapseln bei 58 Grad Celsius aus, bis sie etwa 24 bis 48 Stunden vollständig gehärtet sind.
Nach dem Peeling der Gelatinekapsel aus dem LR-weißen Harz den Harzblock unter das Stereomikroskop legen. Mit einer scharfen Rasierklinge den LR-weißen Block in einem 45-Grad-Winkel zur Probe zu schneiden. Drehen Sie die Probe und machen Sie einen zweiten Schnitt in einem 90-Grad-Winkel zum ersten.
Fahren Sie mit dem Schneiden im gleichen Muster fort, um eine Pyramide mit dem Scheitelpunkt der Pyramide direkt über dem Interessenbereich der Probe zu bilden, und beginnen Sie dann mit dem Entfernen feiner Scheiben senkrecht zur Hauptachse, bis die Schnittfläche die Probe erreicht. Die Zielprobe sollte idealerweise in trapezförmiger Form eingeschlossen werden. Legen Sie den getrimmten Harzblock in das Ultramikrotome.
Passen Sie den Winkel zwischen der Messerkante und dem Harzblock an. Schneiden Sie Abschnitte aus dem Block mit einer Dicke zwischen 200 und 700 Nanometern. Verwenden Sie eine Drahtschleife, um einige abgetastete Abschnitte vorsichtig aus dem Mikrotome zu heben.
Legen Sie sie in einen Tropfen destilliertes deionisiertes Wasser auf eine Glasrutsche. Verdunsten Sie das Wasser, indem Sie die Rutsche auf einer heißen Platte bei 50 Grad Celsius platzieren, und fügen Sie dann einen Tropfen Fleck zu den Abschnitten hinzu. Nach 30 Sekunden spülen Sie den Fleck ab und beobachten Sie das Dia unter dem Mikroskop, um den allgemeinen Zustand des Abschnitts zu überprüfen und die gewünschte Pflanzenstruktur sichtbar zu machen.
Bereiten Sie eine saubere Reaktionsrutsche vor, indem Sie einen Tropfen destilliertes entionisiertes Wasser in jeden Brunnen der Rutsche legen. Übertragen Sie ein oder zwei Probenabschnitte auf jeden Tropfen Wasser. Die Rutsche in eine 10 Zentimeter große Petrischale geben, bedecken und bei 50 Grad Celsius trocknen lassen.
Um eine Inkubationskammer für die Reaktionsschlitten vorzubereiten, legen Sie einige gedämpfte Papiertücher an die Unterseite einer Pipettenspitzenbox und wickeln Sie die Box mit Aluminiumfolie. Übertragen Sie die Dias von der Box in die Inkubationskammer. Pipette 50 Mikroliter Blockierlösung in jeden Brunnen.
Nach dem Inkubieren der Rutsche für 10 Minuten, entfernen Sie die blockierende Lösung, dann waschen Sie alle Brunnen zweimal mit PBS für 10 Minuten jedes Mal. Nach der Vorbereitung der primären Antikörperlösungen, wie im Manuskript beschrieben, führen Sie eine abschließende Wäsche der Brunnen mit destilliertem entionisiertem Wasser für fünf Minuten durch. Pipette die primäre Antikörperlösung in die Reaktionsbrunnen, dann Pipette die Blockierlösung in die Steuerbrunnen.
Schließen Sie die Inkubationskammer. Lassen Sie es für zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen und dann kühlen Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie eine 1%-Lösung des sekundären Antikörpers in der Blockierungslösung vor.
Etwa 40 Mikroliter pro Brunnen werden benötigt. Bedecken Sie die Lösung mit Aluminiumfolie. Waschen Sie die Brunnen der Reaktionsrutsche zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem entionisiertem Wasser für jeweils 10 Minuten.
Stellen Sie sicher, dass keine Sperrlösung oder Ablagerungen in den Brunnen verbleiben. Pipette die sekundäre Antikörperlösung in alle Brunnen. Inkubieren Sie die Dias im Dunkeln bei Raumtemperatur für drei bis vier Stunden.
Erneut die Brunnen der Reaktionsrutsche zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem entionisiertem Wasser waschen, dann einen Tropfen Calcofluor White zu jedem Brunnen hinzufügen. Ohne Waschen, fügen Sie einen Tropfen Montagemedium zu jedem Brunnen und decken Sie jeden Brunnen mit einem Deckel. Beobachten Sie die Probenabschnitte im Reaktionsschlitten mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Verwenden Sie für jede Beobachtung einen UV-Filter, um Zellwände zu erkennen, die vom Calcofluor und einem FITC-Filter gefärbt sind, um die Immunlokalisierung zu erkennen. Um die Ergebnisse besser zu können, verwenden Sie ImageJ oder ein ähnliches Bildanalyseprogramm, um jedes UV-Filterbild mit dem entsprechenden FITC-Filterbild zusammenzuführen. Durch die Lokalisierung bestimmter Epitope ermöglicht das Protokoll die Charakterisierung der Zellwandzusammensetzung.
Zum Beispiel ist 1, 5-Arabinan reichlich in der Zellwand des sich entwickelnden Quercus suber Anther. Kaum veresterte Homogalacturonane finden sich typischerweise an der Wurzelspitze des Quercus suber embryo, der die mechanischen Eigenschaften des Organs angibt. Xylogalacturonane finden sich in degenerierenden Zellen, wie der Endospermzelle in den letzten Stadien der Quercus suber acorn reifation.
Die von JIM13 oder JIM8 anerkannten Epitope von AGP finden sich auf Strukturen im Zusammenhang mit der Reproduktion, wie Zelllinien im Zusammenhang mit der Mikrogametogenese in Arabidopsis thaliana und der stigmatischen Papille und mikrobiell des basalen Angiospermtrien-Tauchmers. Häufige Fehler bei der Implementierung dieses Protokolls sind in der Regel leicht zu erkennen und zu identifizieren. Wenn die Wäschen übersprungen werden oder die Reaktionsbrunnen trocknen dürfen, erscheint der sekundäre Antikörper in der Regel als Abstrich.
Aggregate von grünem Fluorchrom bilden sich, wenn der ungebundene Primärantikörper nicht richtig weggespült wird. Falten oder Ablösen der Abschnitte ist in der Regel mit schlechter Haftung aufgrund der Verwendung von unsauberen Rutschen oder aggressive sanieren verbunden. Auch die Probenvorbereitung ist von entscheidender Bedeutung.
Die Harzblöcke sollten frei von Rissen mit einer deutlich sichtbaren hellgelben bis hellbraunen Probe sein. Ineffizient eingebettete Proben zeigen pulverförmige weiße Flecken oder Flächen. Die Beibehaltung der Probengröße unter acht Millimetern ist für das Eindringen der fixativen Lösung unerlässlich.
Schlecht fixierte Proben erscheinen dunkelbraun oder fast schwarz. Übermäßige Temperatur kann dazu führen, dass das Harz risse, was eine Verteilung der Probe unmöglich macht. Der Einsatz von Immunlokalisierungstechniken eröffnet mehrere Forschungsrichtungen.
Man kann mit spezifischeren Techniken wie der biochemischen Analyse der Zellwand weitermachen oder sogar zu einem molekularen Ansatz übergehen. Die Ergebnisse dieser Technik können helfen, die Zusammensetzung der Zellwand zu verstehen, eine extrem komplexe Struktur, die durch einfache chemische Analyse sehr schwer zu analysieren ist.
