Die Schlüsselfrage, die diese Methode anspricht, ist, ob eine Sorte interessanter Chlamydomonas die Fähigkeit zu Fotoverhalten behält oder nicht. Diese Methode ist einfach, schnell und leicht zu testen, ob eine Sorte interessanter Exponate Fotoverhalten zeigt. Diese Methode kann zur Photobiologie und Zellbiologie der Ziliarmotilität beitragen.
Atsuko Isu, eine Labortechnikerin aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Fügen Sie zunächst zwei bis drei Milliliter Zellsuspension in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale hinzu und stellen Sie die Schale auf einen Leuchtkasten. Schütteln Sie die Schale vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen und vor dem Erleuchten ein Bild zu erhalten.
Beleuchten Sie die Schüssel von einer Seite mit einer grünen Leuchtdiode oder LED in einem dunklen Desktop-Raum. Lassen Sie die Schüssel etwa fünf Minuten stehen, bevor Sie Bilder aufnehmen. Für den Phototaxis-Assay mit Zellkulturtröpfchen werden 25 Mikroliter Zellsuspensionströpfchen mit einer Mikropipette direkt auf eine weiße Kunststoffplatte gelegt.
Beleuchten Sie die Tröpfchen von einer Seite mit einer grünen LED in einem dunklen Desktop-Raum und lassen Sie sie drei Minuten stehen, bevor Sie Bilder aufnehmen. Legen Sie 30 Mikroliter Zellaufhängung auf einen Glasobjektträger und platzieren Sie einen 18 x 18 Millimeter großen Abdeckschlitten mit Abstandshaltern an der Seite. Beleuchten Sie die Proben von einer Seite des Deckglases ohne Abstandshalter mit einer grünen LED und beobachten Sie die Zellen unter einem Dunkelfeldmikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse unter schwachem rotem Licht.
Nach der Lichtbeleuchtung zeichnen Sie die Zellbeleuchtung 20 Sekunden lang mit einem mit einer Kamera ausgestatteten Mikroskop auf. Für den Photoschock-Reaktionsassay legen Sie 30 Mikroliter Zellsuspension auf einen Glasobjektträger und legen Sie einen Abdeckzettel mit Abstandshaltern auf den Objektträger. Beobachten Sie die Zelle unter einem Mikroskop mit schwachem rotem Licht.
Wenden Sie Blitzbeleuchtung mit einem Kamerablitz an, während Sie die Zellbewegung aufzeichnen. Ein repräsentatives Beispiel für negative Phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii nach fünf Minuten Seitenbeleuchtung ist hier gezeigt. Die meisten Zellen sammelten sich auf der gegenüberliegenden Seite der Lichtquelle an.
Im Photoschock-Antwort-Assay zeigten fast alle Zellen die Photoschock-Reaktion. Die Zellen schwammen für kurze Zeit rückwärts und erholten sich vorwärts schwimmend. Um dieses Verfahren durchzuführen, verwenden Sie Aridimigudolphasenzellen und setzen Sie sie vor dem Assay dem roten Licht aus.
Wenn sie nicht dem roten Licht ausgesetzt sind, werden die Zellen unempfindlich gegenüber dem Licht. Diese Technik isoliert verschiedene Mutanten mit abnormalen Phototaxis von Photoschockreaktionen. Darüber hinaus wurden verschiedene intrazelluläre und extrazelluläre Faktoren identifiziert, die das Fotoverhalten beeinflussen.
